TECHNICKÁ HLEDISKA

This content is also available in: English Türkçe

1. FNC a p?íprava nát?r?
2. Základní barvení
3. Zpracování FNC materiálu a pomocné techniky
4. Cytospin
5. Cytoblok
6. Imunocytochemie (ICC)
7. Pr?toková cytometrie (flow cytometry FC)
8. Fluorescen?ní in situ hybridizace (FISH)
9. Polymerázová ?et?zová reakce (PCR)

FNC a p?íprava nát?r?

• FNC hmatných uzlin je nejlepší provád?t s jehlami 23-25G, s nebo bez aspirace. Malé uzliny (menší než 1cm v pr?m?ru) lze lépe zasáhnout kratší jehlou bez aspirace – dostanete se blíže k cíli.
• Fixujte uzlinu dv?ma prsty, v p?ípad? axilárních uzlin se je pokuste znehybnit na hrudní st?n? “tahem dol?“ dv?ma prsty.
• snažte se zkrátit vzdálenost mezi k?ží a uzlinou a zave?te jehlu do hloubky nutné k projití uzlinou.
• FNC nehmatných a hlubokých uzlin se provádí pod sonografickou kontrolou. Zvolte nejkratší a nejp?ím?jší cestu: ?ím delší a zešikmen?jší p?ístup je, tím v?tší je riziko odklonu jehly. Snažte se zasáhnout nejd?ležit?jší oblast.
• Všímejte si vjem? p?i aspiraci: první odpor je tvo?en k?ží, poté následuje pouzdro. FNC vnit?ku uzliny m?že vyvolávat dojem aspirace dutiny. V tom p?ípad? jste zasáhli cíl.
• Pohybujte jehlou jemn? nahoru, dol? a do stran, v rozsahu odpovídajícím velikosti uzliny.
• P?i pohybu jehly se dotažte pacienta, zda cítí bolest. Pokud ano, m?žete být mimo uzlinu.
• Vyhodno?te odpor aspirátu: m?kký, tvrdý, fibrosní, k?ehký. To m?že pomoci p?i hodnocení.
• Kontrolujte vrchol jehly p?i aspiraci. Když se objeví materiál, okamžit? ukon?ete aspiraci a ud?lejte nát?ry. Krev m?že snížit kvalitu vzorku a znemožnit další FNC.
• Aspirace by nem?la trvat déle než 20-30 sekund s výjimkou fibrózních vzork?, delší nejsou výt?žn?jší a vyvolávají mikrohemoragie.
• Vypláchn?te materiál velmi jemn?. Pokud se rozd?lí na malé kapky, m?žete po?ídit více nát?r? nebo cytoblok.
• Techniku volte dle kvality aspirátu: ?ídký zpracujte jako tekutinu, hustý jako p?ímý nát?r.
• Rozt?r by m?l být lehký s vytvo?ením jednovrstevného nát?ru, který okamžit? zaschne bez narušení morfologie lymfocyt?.
• Vyhodno?te ihned pomocí Diff Quik barvení výt?žnost a rozhodn?te, zda je t?eba dalšího vpichu a také, jak dále pracovat se vzorkem. 

základní barvící

Diff Quik a Papanicolaou jsou komplementární a nejužívan?jší barvící postupy. Diff Quik umožní okamžité vyhodnocení nát?r?, zachová pozadí a zvýrazní metachromázii pojiva a oranžová granula eozinofil?. Papanicolaouovo barvení poskytuje detailní informaci o jád?e a cytoplazm?. Pokud je t?eba, m?že být nát?r odbarven a použit pro imunocytochemické pr?kazy.

Zpracování FNC materiálu a speciální metody

Zpracování diagnostického materiálu je základním bodem v diagnostické cytologii, a zejména vcytopatologii uzlin; perfektní nát?ry a jejich okamžité hodnocení jsou prvními kroky správné a p?esné diagnózy. Speciální metody jsou nezbytné pro p?esnou diagnózu a nepostradatelné v diagnostice non-Hodgkinových lymfom? (NHL). Nicmén? ne každá cytologická laborato? disponuje všemi uvedenými metodami; každá má svou specifickou indikaci. Nap?. pr?toková cytometrie, která poskytne extrémn? užite?nou informaci v diagnostice a klasifikaci NHL, je neužite?ná ve vyšet?ení Hodgkinových lymfom? (HL) a metastáz. Naproti tomu imunocytochemie v kombinaci morfologických znak? a imunofenotypu p?ispívá významn? k diagnóze HL a metastáz; m?že však být mén? ú?inná v hodnocení lehkých ?et?zc? nebo ur?ení T-rich B-bun??ný NHL. FISH je vysoce ú?inná v odhalení specifických typ? NHL, ale užívá se pouze výb?rov? po základní diagnostické orientaci. Tyto okolnosti, omezené množství materiálu a nutnost ekonomického postupu vedly k vytvo?ení následujícího algoritmu.

Speciální metody jsou nepostradatelné v diagnóze a klasifikaci v?tšiny FNC uzlin. Poskytují specifické informace a m?ly by být použity indikovan? po zvážení klinických dat a morfologických rys?.

Cytospin

Materiál z jehly po zhotovení nát?r? nebo ze zvláštního vpichu suspendujte v pufru p?i pH 7.4. Jeden až dva milióny bun?k získané jedním vpichem posta?í k vytvo?ení šesti a více cytospin? pro imunocytochemii. Zaschnutím fixované  cytospiny lze skladovat p?i pokojové teplot? až 1 týden. Skladování delší dobu (1-2 roky) vyžaduje -20°. Jak alkalická fosfatáza, tak  imunoperoxidáza mohou být použity pro cytospin.

Cytoblok

Cytobloky se p?ipravují zalitím centrifugované bun??né suspenze do parafinu. Používají se cytoblokové  kazety pro bun??né suspenze. Výhodou cytoblok? je možnost ?etných ?ez?, dlouhodobá skladovatelnost a imunoreaktivita shodná s tká?ovými histologickými ?ezy.

Imunocytochemie (ICC)

Pro tyto ú?ely se používají etanolem fixované nát?ry nebo xylenem odparafinované a alkoholem rehydrované parafinové ?ezy z cytobloku. ?ezy se umístí do kádinky s 0.01 M tri-natriumcitrátového roztoku zah?ejí 3×5 minut v mikrovlnné troub?.  Po zah?átí se pe?liv? oplachují 5 min. v chladné tekoucí vod? a následn? v Tris-pufru (TBS) pH 7. 4. po inkubaci s primární protilátkou jsou skla p?evrstvena biotinylovaným  anti-myším nebo anti-králi?ím imunoglobulinem a následn? peroxidázou zna?eným streptavidinem (LSAB); Signál se vyvolá použitím diaminobenzidinu (DAB) jako chromogenu po inkubaci s k?enovou peroxidázou po dobu 10 minut.

Pr?toková cytometrie (FC)

Zbytkový materiál z jehly nebo ze zvláštního vpichu je suspendován v  RMPI-1640 pufru p?i pH 7.4. Jeden až dva milióny bun?k získaných jedním vpichem se rozd?lí do 6 zkumavek pro šest základních fluoresceinem zna?ených protilátek.  Používají se v kombinaci t?í nebo ?ty? zna?ených r?znými fluorochromy pro dvoulaserový cytometr. Je záhodno ponechat jednu zkumavku v zásob? pro další hodnocení. Konjugace se zna?enou protilátkou musí být ?asov? omezená, protože vitální bu?ky mohou v suspenzi bobtnat. Po konjugaci lze zabránit bobtnání fixací p?idáním kapky pufrovaného formalinu; analýzu lze potom odložit nebo opakovat, Výhodou pr?tokové cytometrie je p?ímá reakce antigenu a protilátky, p?esná kvantifikace exprese antigenu, zjišt?ní koexprese jednou bu?kou. Nevýhodou je absence morfologie, ztráta velkých bun?k, obtíže se zjišt?ním po?etn? ?ídkých bun??ných populací.

Fluorescen?ní in situ hybridizace (FISH)

Fluoresceinované DNA sondy se využívají k vizualizaci specifických segment? DNA. Chromozomální abnormality, zejména translokace a delece lze znázornit a kvantifikovat. FISH lze provád?t na nát?rech nebo cytospinech. Výhodou cytospin? jsou: vysoká koncentrace bun?k, úspora sond a krátký ?as pro analýzu.

Polymerázová ?et?zová reakce (PCR)

Aspirované bu?ky se suspendují v roztoku RNAlater® pro zachování a extrakci RNA a DNA. Bu?ky mohou být skladovány do extrakce DNA p?i pokojové teplot?. DNA segmenty jsou amplifikovány užitím oligonukleotidových sond a polymeráz v opakovaných cyklech denaturace nasednutí primer? a syntézy DNA. Produkty amplifikace jsou analyzovány gelovou nebo kapilární elektroforézou. Pro ur?ení polyklonality a monoklonality se používá amplifikace JH lokusu t?žkých ?et?zc? nebo Tc receptoru.