TEKNİK YÖNLER

This content is also available in: English Čeština

• ??A’u ve yayma haz?rlama
• Temel boyama
• ??S materyal yönetimi ve yard?mc? teknikler
• Sitospin
• Hücre blo?u
• ?mmünosiyokimya (?SK)
•  Ak?m sitometri (AS)
• Floresan in situ hibridizasyon (FISH)
•  Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)

??S ve yayma haz?rlama

• Palpe edilebilen  lenf nodlar?n?n ??A’u 23-25 gauge i?ne ile aspirasyon ile ya da aspirasyonsuz uygulanmal?d?r. Küçük lenf nodlar?nda (1cm ya da daha küçük) hedefe daha yakla?abilmek için,  aspirasyon ekipman? olmadan,  daha k?sa i?ne ile yakla??m daha kolay olabilir.
• Lenf nodunu iki parmak aras?nda sabitleyin; aksiller lenf nodlar?nda hedefi iki parmak ucuyla ”a?a?? çekerek”  gö?üs duvar?nda sabitlemeye  çal???n.
• Deri ve hedef aras?ndaki mesafeyi k?saltmaya çal???n ve orant?sal olarak i?neyi gerekli  mesafe boyunca sokun.
• Palpe edilemeyen veya derin lenf nodlar?n?n ??A’nunun  ultrason kontrolü alt?nda uygulanmas? gereklidir. Bu durumda en k?sa ve en direkt yolu seçin: yol ne kadar uzun ve ne kadar oblik ise i?nenin deviasyon riski o kadar fazla olur. ??ne hareketleri s?n?rl?d?r; lenf nodu yeterince büyükse en önemli k?sm?na ula?maya çal???n.
• Alg?lamalar?n?za dikkat edin : deri ilk direnci , kapsül  daha az direnci gösterir; lenf noduna girildi?inde ise bir bo?lu?a girmi?siniz gibi hissedersiniz, e?er öyleyse hedefe ula?t?n?z demektir.
• ??neyi hafifçe yukar?, a?a?? ve yanlara, hedefin boyutuyla orant?l? bir yar?çap çizerek haraket ettirin.
•  ??neyi hareket ettirirken hastan?n a?r? duyup duymad???n? sorgulay?n, e?er a?r? varsa hedeften sapm?? olabilirsiniz.
• ??nelemeyi de?erlendirin: yumu?ak, sert, fibröz, parçalanan vb. Bu veriler  yaymalar? de?erlendirirken size yard?mc? olabilir.
• ??nenin ‘hub’ ?n? aspirasyon s?ras?nda kontrol edin; materyal gelmeye ba?lay?nca ??A’nunu durdurun ve yaymalar? haz?rlay?n. ??ne ‘hub’?nda kan görürseniz geçi?i hemen  durdurun; kan yayman?z? bozabilir ve mikrohemoraji ikinci bir geçi?i riske atabilir.
• Aspirasyonlar,  i?nelemede ‘fibröz’  olgular d???nda, 20-30 saniyeyi a?mamal?d?r, daha uzun aspirasyonlar yarars?z olabilir veya mikrohemorajiye neden olabilir.
•  Aspire materyali hafifçe püskürtün; e?er küçük damlalara bölerseniz tek geçi?e ait ek yaymalar haz?rlayabilir ya da materyali hücre blo?u veya yard?mc? teknikler için kullanabilirsiniz.
• Yayma tekni?ini materyalin kalitesine göre seçin: s?v? materyal için hematolojik teknik (periferik kan vb.)  ve yo?un materyal için direkt yayma.
• Havada hemen kuruyan tek tabakal? yaymalar elde etmek için yayma yeterince hafif ve lenfositlerin morfolojilerini korumak için de yeterince nazik olmal?d?r.
• Hemen Diff Quik ile  boyad???n?z bir yaymay? yeterlilik aç?s?ndan  ve materyali nas?l yönetece?inize ve ek geçi? gereklili?ine karar vermek  için de?erlendirin.

Temel boyama

Diff Quik  (May-Grunwald Giemsa)   ve Papanicolaou birbirinin  tamamlay?c?s? olan  ve en çok yarar sa?layan boya tipleridir. Diff Quik, yaymalar?n hemen de?erlendirilebilmesini sa?lar, zemini korur, fibröz ba? dokusu metakromazisini  ve eozinofillerin oranj granüllerini vurgular. Papanicolaou,  nükleus ve sitoplazma hakk?nda detayl? bilgi sa?lar ve gerekti?inde yayma soldurularak immünositokimyasal boyalar için kullan?labilir.

FNC material management and ancillary techniques  

 ??S materyal yönetimi ve yard?mc? teknikler

Diagnostik mateyalin yönetimi diagnostik sitoloji için, özellikle de lenf nodu sitopatolojisi için, çok önemli bir noktad?r; mükemmel yaymalar ve bunlar?n hemen de?erlendirilmeleri do?ru ve kesin tan? için ilk ad?mlard?r. Kesin tan? için yard?mc? teknikler gereklidir ve non-Hodgkin lenfoma (NHL) olgular? için vazgeçilmezdir. Her ?eye ra?men bu tekniklerin hepsi temel sitoloji laboratuvarlar?nda elde haz?r de?ildir ve her birinin kendine has uygulamalar? vard?r. Asl?nda, NHL tan?s? ve s?n?fland?rmas? için son derece yararl? bilgi sa?layan ??AS, Hodgkin lenfoma (HL) ve metastazlar?n tan?s?nda uygun de?ildir. Tersine, ?SK morfolojik detaylar ve immünofenotipik özelliklerin birle?imiyle HL ve metastazlar?n tan?s?nda yüksek oranda katk? sa?larken, hafif zincir de?erlendirmesinde ya da T-zengin B-hücreli NHL tan?mlanmas?nda daha az etkili olabilir. FISH, spesifik NHL antitelerinin tan?mlanmas?nda çok etkilidir fakat genellikle sadece öngörülen  tan?sal oryantasyonda kullan?l?r. Bu sorunlar, ??AS materyalinin genel olarak azl??? ve teknik kaynaklar?n verimli kullan?m?n?n gereklili?i a?a??daki algoritmay? önermi?tir.

Yard?mc? tekniklerin ço?u, lenf nodu ??S de tan? ve s?n?fland?rma için vazgeçilmezdir. Her biri spesifik bilgi sa?layabilir ve klinik veriler ile sitolojik özellikler birlikte göz önünde tutularak kullan?lmal?d?r.

Sitospin

‘Hub’ da kalan  ve/veya ikinci geçi?te elde edilen materyal  pH 7.4’lük tampon bir solüsyonda süspanse edilebilir. immünositokimya için kullan?labilecek alt? ya da yedi sitospin haz?rlamak için, tek bir geçi?te kolayl?kla  elde edilebilecek, bir veya iki milyon hücre gereklidir. Havada kurumu? sitospinler oda s?cakl???nda 1 haftaya kadar saklanabilir; daha uzun süreler ( 1-2 y?l) için -20°de saklanmalar? gerekir. Hem immünoalkali fosfataz hem de immünoperoksidaz sitospin üzerinde kullan?labilir.

Hücre Blo?u

Hücre bloklar?, santrifüj edilmi?  hücre süspansiyon çökeltilerinin parafine gömülmesiyle haz?rlanabilir; formalin tesbitli hücre süspansiyonlar? için Cytoblock kasetleri kullan?labilir. Hücre bloklar?n?n ana avantajlar? çok say?da kesit elde edilebilmesi, uzun süre saklanabilmeleri ve formalin tespitli histolojik kesitlerle ayn? antijenik özellikte olmalar?d?r.

?mmünositokimya (?SK)

Etanol tespitli yaymalar veya hücre bloklar?ndan elde edilen  ksilenle  deparafinize ve alkolle rehidrate edilmi? parafin kesitler bu amaç için kullan?labilir. Lamlar 0.01 M tri-sodium sitrat solüsyonuyla dolu ?alelere yerle?tirilir ve mikrodalgada 5’er dakika 3 kez ?s?t?l?r. Is?tman?n ard?ndan lamlar;  ?l?k, akan suda 5 dakika ve sonras?nda ph 7.4  Tris-Buffer Salin  (TBS) ile y?kan?r. Primer Ab ile inkübasyonun ard?ndan, lamlar biotinilize anti-mouse veya anti-rabbit immünoglobulinlerle kaplan?r, peroksidaz i?aretli streptavidini (LSAB) takiben 10 dakika Horse Peroxidase Enzime (HRP) inkübasyonundan sonra kromojen olarak diaminobenzidine (DAB) kullan?larak sinyal geli?tirilir.

Ak?m sitometrisi (AS)

??ne haznesinde kalan ya da ek i?nelemelerle  elde edilen materyal  RMPI-1640 veya pH 7.4’de tampon solüsyonda süspanse edilebilir.  Tek geçi?le toplanabilecek bir ya da iki milyon hücre, temel floresan panel antikorlar? için alt? tüpe da??t?l?r. Bunlar çifte laser instruman? kullan?larak farkl? florokromlarla konjuge edilmi?  üç veya dört antikor grubuyla kullan?l?r. Floresenize antikor konjugasyonu zaman?nda uygulanmal?d?r zira süspansiyondaki vital hücreler ?i?ebilir. Konjugasyon sonras?nda hücre ?i?mesi bir damla tamponlanm?? formalin eklenerek tespitle engellenebilir, böylece analiz ertelenebilir veya tekrarlanabilir. ??AS’nin avantajlar?: direkt antijen-antikor reaksiyonu, antijen ekspresyonunun tam say?m? , ayn? hücrelerde iki farkl? antikorun ko-ekspresyonudur. Dezavantajlar?  ise morfolojinin yoklu?u, büyük hücrelerin kayb?, say?sal olarak az hücre popülasyonlar?n?n tan?mlanma güçlü?ü.

Floresan in situ hibridizasyon (FISH)

Spesifik DNA segmentlerini vizüalize etmek için floresenize DNA problar? kullan?l?r. Kromozom anomalileri, yani translokasyonlar ve delesyonlar gözlenebilir ve ölçülebilir. FISH yaymalar veya sitospinler üzerinde uygulanabilir. Sitospin kullan?m?n?n avantajlar?: yüksek hücre konsantrasyonu, prob tasarrufu ve k?sa analiz süresidir.

Polimeraz zincir reaksiyonu

Aspire hücreler,  hem RNA hem de DNA prezervasyonu ve ekstraksiyonu için RNAlater® içinde süspanse edilebilir. DNA ekstraksiyonuna kadar hücreler oda s?cakl???nda saklanabilir. DNA segmentleri  oligonükleotid problar? ve polimeraz enzimleriyle tekrarlayan denatürasyon, ‘annealing’ ve ekstansiyon  döngüleriyle amplifiye edilir. Amplifikasyon ürünleri jel elektroforez veya kapiller elektroforez ile analiz edilebilir. Ig zincirlerinin JH lokusü veya Tc reseptörü amplifiye edilebilir ve monoklonalite veya poliklonalite için de?erlendirilebilir.