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Citologia basata su liquidi

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Principi di preparazione dei vetrini di citologia basata sui liquidi

  • Il campione di cellule viene raccolto dalla cervice tradizionalmente mediante una spatola o uno strumento di campionamento
  • Il campione viene trasferito in un contenitore o in un mezzo di trasporto
  • Una parte della sospensione viene selezionata per essere processata
  • Le cellule sono separate mediante centrifugazione o filtrazione, depositate su un vetrino come strato sottile / monostrato tramite sedimentazione o applicazione di pressione
  • I vetrini vengono colorati e montati per essere visti al microscopio

Vari sistemi sono attualmente disponibili. I più comunemente utilizzati sono:

  • Sure Path (autocyte, TriPath Imaging)
  • Thin Prep (CYTYC)
Surepath Processing system
Thinprep 2000 processor (CYTYC)

Caratteristiche principali dei sistemi Surepath e Thinprep

  • E’ consigliato un brushing o brooming cervicale per raccogliere i campioni di citologia basata su liquidi. Lo strumento viene ruotato 5 volte attorno all’orifizio uterino esterno in direzione oraria
  • La testa della spatola viene rimossa e posta in un contenitore con un fissativo (Surepath), oppure viene agitata vigorosamente in un mezzo di trasporto in un contenitore con un fissativo (Thin Prep)
  • Le cellule vengono separate dalla sospensione mediante centrifugazione (Surepath) o filtrazione (Thin Prep)
  • Le cellule vengono depositate sul vetrino in un’area ovale o circolare mediante sedimentazione (Surepath) o mediante pressione controllata (Thin Prep)
  • L’area per l’analisi al microscopio è di 13 mm di diametro (Surepath) e di 20 mm di diametro (Thin Prep)
  • Entrambi i sistemi Surepath e Thin Prep sono automatizzati

Confronto della raccolta e della preparazione degli strisci convenzionali con i vetrini di citologia basata su liquidi:

Conventional preparation
Conventional preparation
Conventional preparation
Liquid based preparation
Liquid based preparation
Liquid based preparation

Vantaggi della citologia basta su liquidi

  • Fissazione immediata con aumento dei dettagli nucleari e citoplasmatici
  • Tutto il materiale raccolto è disponibile per la valutazione al microscopio
  • Un campione rappresentativo viene allestito per la valutazione citologica ma multipli campioni posso essere allestiti secondo il necessario
  • Sfondo più chiaro in modo tale che le cellule epiteliali di interesse siano meno probabilmente oscurate
  • Uno sottile strato di cellule disperse viene diffuso su di un’area fissata così che l’area da analizzare sia piccola e l’analisi del preparato richieda minor tempo rispetto ad uno striscio convenzionale
  • Ridotta percentuale di insuccesso
  • I campioni LBC possono essere adatti per altri tests ad es. test di HPV
  • I vetrini LBC sono adatti per un’analisi automatica

Svantaggi della citologia basta su liquidi

  • I quadri osservati negli strisci sono alterati per la randomizzazione delle cellule
  • Le cellule patologiche vengono disperse
  • Preparati di LBC scarsi possono essere difficilmente visti ed interpretati
  • L’infiammazione muco-ematica e la diatesi maligna sono sempre presenti ma sono lievemente differenti
  • Le cellule epiteliali appaiono prevalentemente come cellule singole e cellule metaplastiche immature
  • LBC è più costosa rispetto all’esame tradizionale

Adeguatezza dei campioni di citologia basta su liquidi

In tutti gli studi pubblicati nel Regno Unito, la percentuale di inadeguatezza è ridotta dall’introduzione della citologia basta su liquidi, sebbene i risultati degli studi internazionali sulle percentuali di inadeguatezza siano stati variabili. Questo ha costituito il più importante fattore nel considerare la possibilità che il Regno Unito dovesse passare dagli strisci tradizionali ai sistemi di LBC. Un importante problema che deve essere risolto è se la riduzione della percentuale di inadeguatezza sia sicura. Stiamo trasformando strisci inadeguati in strisci adeguati negativi o stiamo perdendo più strisci patologici mediante questa riduzione di percentuale? E’ chiaro che è necessario ulteriore approfondimento sui criteri per determinare l’adeguatezza nei preparati di LBC. Si riconosce che gli attuali criteri di adeguatezza per gli strisci Pap tradizionali sono soggetti a variazioni tra i laboratori, con conseguente scarsa standardizzazione di questa categoria diagnostica.

Criteri di Bethesda per la determinazione dell’adeguatezza dei campioni di LBC

  • Ogni campione con cellule patologiche è per definizione soddisfacente per la valutazione
  • Un minimo di 5000 cellule squamose ben visualizzate/conservate deve essere visto al microscopio
  • Un minimo di 10 campi deve essere contato, di solito con l’ingrandimento 40x, lungo il diametro che comprende il centro del preparato
  • I vetrini con meno di 5000 cellule devono essere esaminati per determinarne la ragione
  • Il numero medio di cellule per campo microscopico necessario ad ottenere 5000 cellule è mostrato nella tabella seguente. Se sono ipocellulati o con aree acellulate, deve essere stimata la percentuale del preparato con aree ipocellulate
Guidelines for estimating the cellularity for Liquid Based Cytology slides (Ref. The Bethesda System 2001)
View rapid method of evaluating cellularity 1
View rapid method of evaluating cellularity 2

Modificazioni della morfologia cellulare in LBC

I principali effetti della citologia basta su liquidi sulla morfologia delle cellule epiteliali nei campioni sono:

  • Perdita di connessioni tra le cellule e la diffusione casuale delle cellule
  • Dispersione delle cellule patologiche
  • I monostrati scarsi posso essere difficili da visionare ed interpretare

Questi sono illustrati nei riquadri seguenti

General Smear Pattern

The overall smear pattern is eliminated – but cell architecture and contextual background similar to that found in a conventional smear. The background pattern is cleaner than in conventional smears making it easier to identify normal and abnormal cells. Blood mucous inflammatory exudate and necrotic debris can still be recognised although they look a little different from conventional smears; the so called “tumour diathesis” can still be recognised in LBC preparation.
Inadequate LBC
Adequate LBC

 

Squamous epithelial cells

The general morphology of epithelial cells is preserved although they mainly appear as single cells. Clumps and sheets of epithelial cells are generally smaller than those seen in conventional smears Endocervical and immature metaplastic cells may appear slightly smaller.The chromatin may appear more granular but should show an even distribution.The nuclear membrane is usually smooth but may be folded

 

Endocervical cells

The typical honeycomb appearance can still be seen but isolated cells and cells in palisade also found. Bare nuclei less frequent in LBC preparations.Nuclei appear crisper and chromatin more granular.Cilia and mucous vacuoles in the cytoplasm may also be seen. Occasionally the cells may be rounded up or twisted due to processing artifact.

 

Immature metaplastic cells

Immature metaplastic  cells may appear smaller in LBC preparations giving the false impression of increased nuclear cytoplasmic ratio. However the smooth nuclear outline, even granular chromatin , occasional small round nucleolus and dense cytoplasm will confirm the benign nature of these cells.

Le cellule endometriali sono spesso ben conservate nei preparati di LBC, a differenza degli strisci tradizionali, dove spesso appaiono piuttosto degenerate. Sono presenti in aggregati o nidi tridimensionali di cellule, ma si possono anche trovare singolarmente. I nuclei sono rotondi o ovali, piccoli, uniformi ed ipercromatici. Dato che il sangue viene lisato nei campioni di LBC, sono visibili solo frammenti di globuli rossi nei campioni mestruali. Si possono vedere istiociti e detriti.

  • Il sangue viene lisato e pertanto solo i frammenti di globuli rossi possono essere visti nei campioni mestruali
  • Le cellule sono raggruppate in aggregati trasparenti e tridimensionali
  • La cromatina è granulare e i ripiegamenti della membrana ben visibili

Pregnancy

Immature metaplastic  cells may appear smaller in LBC preparations giving the false impression of increased nuclear cytoplasmic ratio. However the smooth nuclear outline, even granular chromatin , occasional small round nucleolus and dense cytoplasm will confirm the benign nature of these cells.

 

LBC image library

Candida
Candida
Clue cell
Endometrial cells
HSIL
HSIL
HSIL
HSIL
HSIL
HSIL
HSIL
Hyperkeratosis
Hyperkeratosis
Hyperkeratosis
Borderline ASCUS
Borderline ASCUS
Borderline ASCUS
Normal squamous epithelium
Degenerative effect of inflammation
Degenerative effect of inflammation
Degenerative effect of inflammation

 

Valutazione di LBC in Inghilterra – Studi pilota

  • Nel Giugno 2000 il National Institute for Clinical Excellence (NICE) ha redatto delle linee guida per l’impiego della citologia basta su liquidi (LBC) nello screening cervicale
  • E’ stato stabilito che la LBC potrebbe fornire benefici significativi ed importanti, ma la entità della evidenza era variabile con persistenza di aree di incertezza
  • Un programma di introduzione pilota della LBC è stato proposto, con revisione completa dei risultati ad ogni stadio
  • Questi progetti avevano lo scopo di valutare tutti gli effetti, i costi e le implicazioni pratiche della introduzione di LBC nel programma di screening cervicale
  • I fabbricanti dei due sistemi ThinPrep® (Cytyc® Corporation, Marlborough, MA, USA) e SurePath T (Tripath Imaging® Inc., Burlington, NC, USA) hanno richiesto che i loro sistemi venissero impiegati e tre sedi sono state utilizzate, due con ThinPrep® ed una con SurePathT.
  • I sistemi sono stati impiegati nel 2001-2002 e 250.000 campioni sono stati esaminati (con circa 12.500 tests di HPV eseguiti). I risultati sono stati confrontati a quelli del periodo precedente ottenuti mediante citologia tradizionale
  • Gli effetti dei costi di laboratorio compresi la strumentazione, i commestibili, la produttività dello staff sono stati considerati, così come la valutazione della efficacia di costo del test di HPV e gli effetti psicologici sulle donne degli strisci inadeguati e dei test HPV positivi.

Risultati dello studio pilota di LBC in Inghilterra

  • L’introduzione di LBC ha determinato una più evidente riduzione della percentuale di inadeguatezza degli strisci (dal 9% ad 1-2%). La percentuale degli strisci inadeguati nello studio pilota è stata inferiore nella sede che utlizzava SurePathT rispetto alle sedi che utilizzavano ThinPrepT.
  • Non c’è stata nessuna chiara evidenza che la LBC potesse avere un qualunque impatto sulle percentuali di rilevamento degli strisci borderline o della discariosi media o, in tutti i centri, a livello generalizzato, sulle percentuali di discariosi moderata e grave
  • C’è stata evidenza di un effetto “curva di apprendimento”, con le percentuali più alte degli strisci borderline e di quelli con discariosi media o moderata riscontrate nei primi due mesi dello studio-pilota
  • C’è stata una riduzione nella percentuale di strisci refertati con presenza di neoplasia ghiandolare
  • Non è possibile stimare la sensibilità direttamente dagli studi pilota, dato che per fare questo sarebbe necessario conoscere i risultati falsi negativi dello screening. Comunque i risultati sulle percentuali di discariosi media e grave ed i risultati provvisori sul valore predittivo positivo suggeriscono che, per le sedi combinate, la sensibilità con LBC non è inferiore alla citologia convenzionale
  • La produttività dei laboratori è aumentata con LBC in quanto per ogni ora possono essere visionati più vetrini nello screening primario; il numero delle pause formali è rimasto invariato.
  • La riduzione della percentuale di in adeguatezza con LBC ridurrà i costi totali di screening dato che meno strisci dovranno essere allestiti, preparati e letti. Per esempio, con una riduzione della percentuale di inadeguatezza dal 9% ad 1,6%, un laboratorio che prima allestiva 30.000 vetrini all’anno avrebbe una riduzione del carico di lavoro di 2.200 vetrini all’anno. A livello nazionale il carico di lavoro verrebbe ridotta da 4,2 milioni di vetrini per anno a 3,9 milioni di vetrini per anno.

Valutazione di LBC in altri paesi

  • A livello nazionale i programmi di screening cervicale sono complessi ed interdisciplinari. Paesi diversi adottano diversi intervalli e strategie di screening. Pertanto gli effetti della introduzione di LBC sarebbero diversi. Australia, Nuova Zelanda, Germania, Francia, Paesi Bassi e Scozia hanno recentemente valutato la LBC e sono giunti a diverse conclusioni.
  • La Scozia sta rendendo effettiva la LBC
  • Australia e la Nuova Zelanda hanno deciso di non sostenere la LBC con finanziamenti pubblici al momento
  • La Società tedesca di Citologia ha inoltre raccomandato ulteriori studi, mentre la relazione francese non è ancora stata pubblicata
  • Dato che i quadri osservati negli strisci sono alterati nelle preparazioni in LBC, una adeguata preparazione nell’ interpretazione degli strisci LBC è essenziale prima di iniziare lo screening di questi preparati
  • Attualmente le società commerciali offrono un corso di preparazione di tre giorni
  • Lo scopo del programma è di preparare i partecipanti
  • I citologi partecipanti sono invitati a ritornare nel loro laboratorio per insegnare a tutto lo staff del laboratorio
  • Lo scopo per i citotecnologi è di raggiungere il 95% di sensibilità per HSIL prima di iniziare lo screening di routine dei vetrini LBC.

Cambiamenti nella conduzione del lavoro (Valutazione di LBC in Inghilterra)

  • La preparazione dei campioni mediante LBC si basa su macchine che preparano tra 25.000 e 80.000 campioni per anno. I modelli proposti per la modernizzazione patologica basata sulle reti gestite si adatterebbero affidabilmente con macchine di queste dimensioni, consentendo un allestimento centralizzato dei preparati, mentre la lettura e la refertazione degli strisci continuerebbero negli ospedali dove il personale di screening è attualmente stazionato.
  • Lo screening automatico approvato dalla FDA è attualmente disponibile per strisci Pap tradizionali e, se applicato alla pratica nel Regno Unito, potrebbe significativamente ridurre il carico di lavoro e gli arretrati.

LBC e screening di HPV

  • L’introduzione del triage basato sui risultati del test di HPV ha portato ad una riduzione del 72% nella percentuale di strisci ripetuti, ma ha più che duplicato la percentuale di ricorso alla colposcopia in queste donne, confrontata con la attuale condotta.
  • Data la mancanza di evidenza conclusiva sulla sensibilità dell’analisi HPV-DNA nel Regno Unito e visto l’impatto del ricorso alla colposcopia osservato negli studi pilota, si raccomanda attenzione dell’impiego del test di HPV per selezionare le donne in questo momento, nonostante i risultati molto promettenti in termini di efficienza di costo

Conclusioni

  • L’evidenza attuale suggerisce che le principali ragioni per l’introduzione della LBC sono rappresentate dall’aumento della produttività in un programma di screening, sia riducendo la percentuale di inadeguatezza, sia aumentando la produttività del laboratorio e dalle future possibilità di automazione e di tests ancillari (anche se questi ultimi non dipendono dal suo uso)
  • Il College mostra dubbi legati alla sensibilità ed alla adeguatezza del campione (che influenzerà la produttività)
  • E’ essenziale che la LBC non sia svenduta come più sensibile degli attuali metodi di screening
  • La maggiori difficoltà dell’apprendimento devono essere adeguatamente affrontate. Sarà richiesto il mantenimento di esperienza negli strisci Pap tradizionali