Fasi nel processo di lavorazione in un laboratorio:

Campione e il modulo di richiesta sono ricevute dal laboratorio
Viene assegnato un numero di referenza di laboratorio
Vengono inseriti sul computer di laboratorio i dati del paziente e il numero di referenza dello striscio
Lo striscio viene processato colorato e montato
I vengono sottoposti ad uno screening primario
Tutti i vetri sono rivisti da un secondo osservatore e le atipia vengono riferite al patologo
Viene preparato un referto finale e inviato al campionatore
Il paziente viene informato del risultato del Pap Test

Ricevimento dei campioni

All’arrivo in laboratorio dello striscio e della richiesta di esame questi devono confrontati per assicurare la correttezza dei dati. Sia il vetro che la richiesta devono avere lo stesso numero indetificativo o codice a barre dato dal laboratorio.
I vetri vengono preparati per la colorazione con il metodo di
Dopo la colorazione il vetro viene montato con DPX e coperto con un coprivetrino (dimensione ottimale 22x50mm).
Occorre far ben asciugare il montante prima di accoppiare il vetro con la richiesta di esame da inviare all’esaminatore.

Il metodo di colorazione di Papanicolaou

Dopo molti anni della sperimentazione, il Dr Papanicolaou sviluppò la colorazione tricromica che tuttora è in uso con piccole modificazioni per la coorazione degli strisci (Papanicolaou 1942: Una nuova procedura per la colorazione degli strisci Science 95,438). Per colorazione ottimale gli strisci non dovrebbero essere mai lasciati asciugare durante la fissazione o il processamento.

Papanicolaou stain:

#	Procedure	Time	Comment
1	Remove polyethylene glycol carbowax fixative In 50% alcohol	2 min’s	Failure to remove carbowax will result in artifact which obscure the cells & is difficult to remove
2	Rinse in water	1 min	Ensure re hydration is complete
3	Stain in Harris Haematoxylin	5 min’s	Staining time will depend on formula of haematoxylin
4	Rinse in water	2 min’s	Unbound haematoxylin is removed
5	Differentiate in 0.5% aqueous hydrochloric acid	10-20 sec’s	_
6	Rinse in tap water	2 min’s	_
7	Blue in Scott’s tap water substitute	1 min	he brown colour of acid haematin is changed to blue/ black by weak alkaline solution 8
8	Rinse in water	2 min’s	Wash thoroughly to remove alkaline salts
9	Dehydrate 70%alcohol	2 min’s	Dehydrate through graded alcohols
10	Dehydrate 95%alcohol	2 min’s
11	Dehydrate 95%alcohol	2 min’s
12	Stain in Orange G6 (OG6)	2 min’s
13	Rinse in 95% alcohol	2 min’s
14	Rinse in 95% alcohol	2 min’s
15	Rinse in 95% alcohol	2 min’s
16	Stain in Gills EA30 solution	3 min’s
17	Rinse in 95% alcohol x3	1 min
18	Clear in xylene x3 and mount in DPX	1 min	Leave in xylene until ready to mount in DPX

Resulting stain:

Nuclei- blue black
Cytoplasm- non keratinised blue and effete red
blood cells- green
Cytoplasm (keratinised)- pink
Red cells- orange

Il risultato finale dovrebbe rendere ben evidente le caratteristiche del citoplasma e la struttura della cromatina nucleare.

Comment on the Papanicolaou staining method:

The Papanicolaou stain is a polychrome staining method which comprises a nuclear stain (haematoxylin) and two counterstains (Orange G and EA dyes). Hydration of the fixed smear is required for the cells to take up the haematoxylin whereas dehydration prepares the smear for the counterstains. Modification of the stain is common as each laboratory prefers its own colour balance. Adjustments are made by altering the length of time in haematoxylin and EA dye. Other factors which may affect the colour balance are chemical content of the tap water, temperature, pH of specimen and number of slides per batch of stain. Providing that the nuclear detail is clearly defined and the transparency of the cytoplasm is maintained, interlaboratory variation of the colour balance is acceptable. However each laboratory should standardise its procedure so the results are reproducible.

The Papanicolaou staining method may progressive or regressive.

In the progressive method the intensity of nuclear staining is controlled by immersion of the slide in a “blueing” agent after the nucleus has been stained to the required intensity with haematoxylin. The blueing agents most commonly used are Scott’s tap water substitute (pH 8.02), ammonium hydroxide and lithium carbonate. (Tap water can be used if the pH is suitable). Progressive staining tints the cytoplasm very lightly.

In regressive staining, the nucleus is deliberately overstained with a non-acidified haematoxylin. The excess stain is removed with dilute hydrochloric acid solution. The decolourising acid is then removed by immersing the slide in running tap water. Timing is important in the regressive method as the outcome may be a hypochromatic nucleus rather than a hyperchromatic nucleus. The cytoplasm is also totally decolourised by the acid solution. Harris’s haematoxylin is usually combined with the regressive staining method. Gill’s or Mayer’s haematoxylin is usually used for the progressive staining method. It is important to remember that the pH of the solution is more important than whether the haematoxolin is used progressively or regressively.

Orange G is an acidic dye which stains basic proteins such a prekeratin a pink colour. Orange G also has a strong affinity for keratin which stains bright orange. Thus it is an important marker of abnormal keratinisation of the cervical and vaginal epithelium such as occurs in prolapse and wart virus infection. It is also a sensitive marker of well differentiated squamous carcinoma of the cervix. It is of utmost importnace that the rinsing baths are clean and the staining solutions are changed frequently otherwise both nuclear and cytoplasmic staining will be defective.

EA is a polychromatic stain which is a combination of light green, SF yellow and eosin Y. It stains the cytoplasm of metabolically active cells (such as parabasal cells intermediate cells leucocytes and histiocytes as well as cancer cells) a light green colour.
However, the colour balance of a Papanicolaou stained slide depends not only on the staining method used but also the commercial source of the stains and the pH of the cell sample. In consequence the Papanicolaou stain cannot be considered to be an exact stoichiometric stain although the correlation between Pap stained and Feulgen stained material is reportedly very high.

For further information about the Papanicolaou stain and general cytopreparatory techniques please consult Chapter 34 , Cytopreparatory Techniques by CM Keebler in Comprehensive Cytopathology (1996) editor M Bibbo pub Saunders.

Screening e referto

Un protocollo di screening dovrebbe essere approvato dal direttore del laboratorio, dovrebbero essere utilizzati sistemi per il controllo di qualità del lavoro e utilizzato personale adatto e sufficiente al carico di lavoro. Per sviluppare personale adatto è necessario che i citotecnici vedano una ampia casistica di preparati. Il laboratorio dovrebbe processare almeno 15000 strisci cervicali all’ anno e ciascun esaminatore dovrebbe vedere 50-80 strisci al giorno con pause intervallate ad ogni ora. L’esaminatore dovrebbe avere la propria postazione di lavoro e il proprio microscopio bioculare.

I preparati dovrebbero essere letti utilizzando obbiettivi con ingrandimento a 10x e con oculari a 10 o 12x. Lo stesso obbiettivo dovrebbe essere usato per la scrinatura di tutto il preparato. L’esaminatore dovrebbe procedere di campo in campo su tutta la sezione finché l’intera area coperta del vetrino coprioggetto venga studiata. In genere la partenza è ad un angolo del vetro e seguendo sempre lo stesso senso di lettura si procede finché tutto il vetrino viene studiato.

è stato valutato che, usando obiettivi a basso ingrandimento, un esaminatore, durante l’analisi di un singolo preparato esamini dai 250 ai 300 campi. Questo richiede un tempo medo di circa 6-10 minuti (con un range dai 5 ai 20 minuti).
Per segnare sul vetro cellule con particolari caratteristiche deve essere utilizzato un ingrandimento a 4x. Un protocollo per per segnalare le cellule deve essere preso in considerazione nel laboratorio.
Per studiare aree di particolare interesse vanno utilizzati ingrandimenti di 20x o 40x.
Il foglio di richiesta del esame citologico e la storia clinica o di screening della paziente devono essere presenti e valutati prima della revisione del vetro.

La terminologia e principi di refertazione degli strisci cervicali

Il referto di citologia dovrebbe essere accurato e conciso così che i suoi contenuti sono capiti facilmente dal chi esegue l’esame, dal personale medico, tecnico ed amministrativo coinvolto nel processo di screenig.
La terminologia deve segnalare informazioni clinicamente attinenti a chi esegue l’esame. Generalmente si è d’accordo sul sistema di refertazione che prevede un testo descrittivo (narrativo) piuttosto che referti schematici e brevi che possono essere mal interpretati. Per questa ragione, sistemi di classificazione numerici incluso quello proposto da Papanicolaou (1954) sono fortemente sconsigliati.

Ci sono cinque componenti in un referto:

Il tipo di campione deve essere indicato es raschiamento cervicale, materiale endocervicle, prelievo per LBC assaggia
Ci dovrebbe essere un commento sull’adeguatezza di campione es. se il campione è soddisfacente per valutazione
Il rapporto dovrebbe includere una breve descrizione delle caratteristiche citologiche in termini facilmente comprensibili
Casi dove sono presenti atipie citologiche le probabili modificazioni citologiche doverebbero essere segnalate.
Un quinto del referto deve darer indicazioni per il trattamento anche se è una accortezza opzionale.

I citologi dovrebbero prendere in considerazione tutti i dati clinici e attinenti la paziente prima di redigere il referto
Si raccomanda che tutti gli strisci atipici vengano refertati da un patologo o da personale qualificato con un particolare conoscenza della patologia ginecologica.