Procesarea probelor citologice în laborator

Procesul de procesare a probelor citologice constă din următoarele etape: primirea specimenului și a fișei de solicitare, pregătirea lamelor pentru examinarea microscopică, colorația, examinarea și raportarea rezultatelor. Toate aceste procese se supun controlului calității și măsurilor de asigurare a calității.

 

Primirea specimenelor și a fișei de solicitare

  • Specimenele și fișa de solicitare se verifică pentru a se asigura că acestea corespund.
  • Specimenele și fișa trebuie să aibă cel puțin 3 identificatori (numele, prenumele, data nașterii, numărul Serviciului Național de Ocrotire a Sănătății, numărul spitalului).
  • Se atribuie un număr de referință al laboratorului.
  • Numărul de identificare a pacientului și numărul de referință a probei se introduc în sistemul de gestionare a informaţiilor de laborator (LIMS).

 

Pregătirea lamelor pentru examinarea microscopică

  • Lamele pentru mediul lichid se pregătesc cu ajutorul echipamentului, cu respectarea instrucțiunilor producătorului.  Cele mai utilizate metode sunt ThinPrep (Hologic) și SurePath. Fiecare laborator trebuie să aibă manualele acestor metode și să treacă la aplicarea lor în practică.
  • Linkurile la toate echipamentele și metodele ThinPrep pentru colectarea probelor pot fi găsite pe pagina principală: http://www.thinprep.com/hcp/ifu/
  • Linkurile la echipamentele și metodele BD SurePath pot fi găsite aici: http://www1.bd.com/anz/training/surepath

 

Colorația cu ajutorul metodei Papanicolaou

  • Metoda de colorație Papanicolaou, regresiva, prezentată în Tabelul 8.xx, se efectuează cu ajutorul mașinii automate de colorație. 
  • Toate lamele se montează, se acoperă cu sticlă și se etichetează.
  • Caracteristicile colorării nucleelor individuale și a coloranților de contrast se verifică zilnic. 

 

Metoda de colorație Papanicolaou

După ani de experimente, Dr. Papanicolaou a creat coloraţia tricromă, utilizată până astăzi (cu modificări minore). Colorația tricromă este o combinație dintr-un colorant nuclear, hematoxilină și doi coloranți de contrast OG-6 și EA-50.  OG-6 colorează cheratina, iar EA-50 (un colorant dublu, eozină și azur) colorează citoplasma celulelor epiteliale scuamoase, nucleolii și eritrocitele. 

Pentru colorație optimă, celulele de pe lamă nu trebuie lăsate să se usuce înainte de a fi fixate sau pe parcursul procesului de procesare, în caz contrar, acest lucru va duce la artefacte nedorite. Întrucât colorația se modifică des, fiecare laborator preferă să aibă un echilibru personal de colorație: ajustările pot să parvină la modificare duratei de timp a hematoxilinei și EA-50.

Variații simple, cum ar fi: conținutul chimic al apei de la robinet, temperatura ambiantă, pH specimenului și numărul de lame colorate per lot, pot afecta echilibrul colorației. Laboratoarele sunt responsabile de menținerea unei intensități constante a colorării, prin verificări de control al calității, pentru a asigura diagnoze citologice corecte.

În cazul în care detaliul nuclear se definește clar și se menține transparența citoplasmei, se acceptă variația echilibrului de colorație între laboratoare.

 

Colorație progresivă sau regresivă

La utilizarea metodei progresive, intensitatea colorației nucleare este controlată prin scufundarea lamei în agentul care albăstrește, după colorarea nucleului, la intensitatea necesară, cu hematoxilină. Cel mai utilizat agent de colorare în albastru este apa lui Scott de la robinet (pH 8.02). Colorația progresivă vopsește foarte delicat citoplasma.

La utilizarea acestei metode, nucleul se colorează în exces, intenționat, cu hematoxilină neacidă. Excesul de culoare se înlătură cu soluție de acid hidrocloric diluat (apă acidă). Apoi procesul de decolorare este oprit prin scufundarea lamei în apa curgătoare de la robinet. La utilizarea acestei metode, un rol crucial îl joacă timpul de executare a procesului, pentru că decolorarea poate să ducă la transformarea nucleului hipercromatic în unul hipocromatic.

Ultima variabilă pentru tehnica de colorație Papanicolaou este în funcție nu doar de metoda de colorație utilizată, dar și de producătorul coloranților și a pH-ului probei de celule. Astfel, tehnica de colorație Papanicolaou nu poate fi considerată drept o tehnică de colorație stoechiometrică exactă.

Ambele metode funcționează atât împreună, cât și separat, în funcție de laborator. Rezultatele generale ale colorării și capacitățile de diagnosticare sunt comparabile.

 

Caracteristicile metodei de colorare Papanicolaou

Nucleul individual

  • Clar vizibil la putere mică (obiectiv x10) și la putere mare (obiectiv x40)
  • Colorarea de la albastru/violet la negru
  • Granular și concis (nu este vag)

Coloranți de contrast (citoplasmă)

  • Celule scuamoase superficiale – roz
  • Mai puține celule (intermediare și metaplastice) mature –albastru/verde
  • Celule cherotinizate deplin – portocaliu.

Coloranții trebuie să aibă aceiași intensitate

Trebuie să existe o transluciditate citoplasmatică cu contrast mare față de colorantul nuclear

 

Figura 8.8 Colorare Papanicoulaou ideală

 

Tabelul 8.1. Metoda regresivă de colorație Papanicolaou (mașină automată de colorare)

Etapa

Soluție

Durată (minute)

1

Alcool 95%

1:30

2

Alcool 70%

1:30

3

Hematoxilină

4:00

4

Apă acidă

0:05

Spălare 1

Apă

Spălare

Spălare 2

Apă

Spălare

Spălare 3

Apă

Spălare

Spălare 4

Apă

Spălare

5

Alcool 70%

2:00

6

Alcool 95%

1:00

7

OG6

2:00

8

Alcool 95%

0:10

9

Alcool 95%

0:10

10

EA-50

6:00

11

Alcool 95%

0:15

12

Alcool 95%

0:15

13

Alcool absolut

1:00

14

Alcool absolut

1:00

15

Alcool absolut

1:00

16

Xilen

3:00

17

Xilen

2:00

Înlăturare

Xilen

1:00

 

Examinarea și raportarea citologiei

  • Citotehnicianul sau specialistul în screeningul citologic examinează lamele.
  • În funcție de protocoalele locale, toate lamele examinate și apreciate drept negative sau inadecvate sunt reexaminate rapid și dacă unele din ele sunt atipice, atunci sunt expediate citotehnicianului superior spre analiză.
  • Rezultatele negative sau inadecvate sunt înregistrate în conformitate cu protocoalele locale.
  • Toate lamele citologice atipice sunt expediate unui consultant patolog, savant superior sau specialist în biomedicină, în funcție de protocoalele locale privind emiterea raportului final.
  • Raportul final este semnat, înregistrat și expediat prin poșta electronică sau cea tradițională specialistului responsabil de recoltarea frotiului.
  • Rapoartele finale cuprind o recomandare privind gestionarea cazului, cum ar fi: trimiterea la o examinare colposcopică sau repetarea testului, în cazul în care proba este inadecvată.
  • Testarea HPV se efectuează dacă este nevoie pentru triajul ASC-US/de nivel scăzut sau pentru testarea gradului de vindecare după tratamentul neoplaziei cervicale intraepiteliale.
  • Pacientul este informat cu privire la rezultatele testului.
  • Clinicianul sau spitalul care expediază proba este responsabil pentru asigurarea unor măsuri corespunzătoare în caz de rezultate atipice,dacă nu există alte protocoale scrise și convenite cu privire la trimiterea la colposcopie și solicitarea repetării testelor.
  • Trebuie să existe un sistem de reamintire a programărilor la colposcopie și repetarea testelor.

Aceste proceduri pot varia între laboratoarele unor regiuni sau țări, totuși la efectuarea acestora, trebuie să se respecte îndrumările europene privind asigurarea calității screeningului cancerului de col uterin (Wieneret al).

 

Protocoalele pentru screeningul citologic convențional și în mediu lichid

Managerul laboratorului în colaborare cu consultantul patolog din cadrul departamentului trebuie să implementeze protocoalele privind procedura de screening și raportare împreună cu măsurile de control al calității.

Pentru a acumula experiență, citotehnicienii trebuie să vadă o gamă vastă de cazuri. Laboratoarele trebuie să proceseze cel puțin 15.000 de frotiuri de col uterin pe an. Se preconizează că fiecare specialist în screening poate examina 50 (de frotiuri convenționale) sau 80 (de frotiuri în mediu lichid) pe an, cu pauze la intervale regulate. Specialistul în screening trebuie să dispună de propriul său loc de lucru, precum și de un microscop binocular și trebuie să tindă să atingă nivelul minim de 3.000 de cazuri pe an.

Lamele pregătite trebuie să fie testate pentru depistarea celulelor atipice, cu utilizarea unui obiectiv x10 și a unui ocular x10, același obiectiv trebuie să fie utilizat în screenengului întregii lame. Specialistul în screening trebuie să examineze fiecare câmp de pe toată lama, până când toată suprafața de sub sticlă este investigată.  De regulă, procesul de screening pornește de la un colț al lamei și derulează progresiv până când întreaga suprafață de sub sticlă este examinată.

 

Figura 8.10 Examinarea frotiului convențional

 

S-a estimat că un specialist în screening verifică aproximativ câte 250-300 de câmpuri în procesul de examinare a unei singure lame (cu utilizarea unui obiectiv x10). Pentru efectuarea examinării citologice a colului uterin este nevoie, în mediu, de 6-10 minute (variind între 5 și 20 de minute).

Sarcina specialistului este de a marca celulele ce prezintă interes de pe frotiul de col uterin. Pentru marcare sau „punctarea” celulelor atipice trebuie să se folosească un obiectiv x4. Laboratorul trebuie să decidă de care protocol de marcare să se conducă, dar în mod normal, la efectuarea examinării citologice în mediu lichid se utilizează marcatoarele colorate, iar la efectuarea celui convențional – cerneala albă pentru punctare. La inspectarea zonelor sau celulelor de interes special, trebuie să se utilizeze un obiectiv x20 sau x40.

Formularul de solicitare a examenului citologic și istoricul examinării colului uterin trebuie să fie oferit la fiecare frotiu, iar citologul trebuie să le verifice înainte de examinarea frotiului.

 

Protocoalele pentru examinarea unei lame ThinPrep

  • Citologii ce trec de la frotiurile convenționale la citologia în mediu lichid, indiferent de tehnologia utilizată, trebuie să urmeze cursuri de instruire. 
  • Pentru ThinPrep se folosește un fixator pe bază de metanol, fixator diferit de cel pe bază de etanol, utilizat la prelevarea frotiului convențional.  Detaliul nuclear se conservă bine pe lamele ThinPrep, însă membrana nucleară este mai vizibilă, lucru ce poate afecta distincția dintre metaplazia scuamoasă imatură și HSIL. 
  • Lamele ThinPrep pot fi examinate dintr-o parte în alta sau de sus în jos, după cum preferă citologul.
  • Nu există orientări specifice pentru examinarea rapidă sau pre-vizualizare.

Protocoalele pentru examinarea unei lame SurePath

  • Citologii ce trec de la frotiurile convenționale la citologia în mediu lichid, indiferent de tehnologia utilizată, trebuie să urmeze cursuri de instruire.
  • Pentru SurePath se folosește un fixator pe bază de etanol și similar celui folosit în citologia convențională.
  • Deși suprafața celulelor examinate pe lama SurePath este mai mică decât pe cea ThinPrep, nu trebuie să se acorde mai puțin timp pentru examinare:  Pregătirea pentru SurePath nu se face într-un singur strat, iar grupurile de celule tridimensionale trebuie să fie focusate la putere mare pentru examinarea grupurilor de celule în sus și în jos.
  • Utilizatorii SurePath recomandă examinarea rapidă a întregii lame, apoi examinarea lentă și minuțioasă a grupurilor de celule tridimensionale.[comunicat personal N Dudding]
  • Nu există orientări specifice pentru examinarea rapidă sau pre-vizualizare.

 

Cursuri de instruire pentru efectuarea citologiei în mediul lichid

  • Medicii specializați în citologie și patologie, care trec de la frotiuri convenționale la citologie în mediu lichid, au nevoie de cursuri speciale de instruire
  • Deși între SurePath și ThinPrep sunt mai multe asemănări decât deosebiri, totuși este nevoie de instruire pentru ambele

 

X