Citología en base líquida

Principios de la preparación de láminas de citología en base líquida (LBC)

  • Una muestra de células es tomada del cervix en la forma usual usando una espátula o un cepillo de muestreo
  • La muestra es transferida a un recipiente que contiene un medio preservativo y de transporte
  • Las células se dispersan en el fluido sobrenadante de la suspensión se selecciona para su procesamiento
  • Las células se separan por centrifugación o filtración y se depositan en una lámina como una capa fina/monocapa por sedimentación o por la aplicación de presión.
  • Las láminas son teñidas y montadas listas para análisis microscópico.

Varios sistemas están actualmente disponibles. Los más ampliamente usados son:

  • Sure Path (autocyte, TriPath Imaging)
  • Thin Prep (CYTYC)
Surepath Processing system
Thinprep 2000 processor (CYTYC)

Características esenciales de los sistemas Surepath y Thinprep

  • Se recomienda el uso de un cepillo o escobilla cervical para tomar las muestras para LBC. El instrumento seleccionado se debe rotar cinco veces alrededor del os cervical en la dirección de las manecillas del reloj.
  • La cabeza del cepillo se separa y se coloca en el contenedor con fijador (SurePath) o es lavado vigorosamente en el medio de transporte en el contenedor con fijador (Thin Prep)
  • Las células son separadas de la suspensión mediante centrifugación (SurePath) o por filtración (Thin Prep)
  • Las células se depositan en la lámina en un área oval o circular por sedimentación (SurePath) o por presión controlada (Thin Prep)
  • El área para análisis microscópico es de 13mm de diámetro (SurePath) y 20mm de diámetro (Thin Prep)
  • Ambos sistemas SurePath y Thin Prep son automatizados

Comparación de la toma de muestras y preparación de las láminas convencionales y la citología en base líquida

Conventional preparation
Conventional preparation
Conventional preparation
Liquid based preparation
Liquid based preparation
Liquid based preparation

Ventajas de LBC

  • Fijado inmediato que realza los detalles del núcleo y del citoplasma
  • Todo el material obtenido está disponible para evaluación microscópica
  • Una muestra representativa es preparada para evaluación citológica pero si es necesario se pueden preparar múltiples muestras
  • El fondo es mas claro, haciendo menos probable que las células epiteliales de interés sean ocultadas
  • Una capa fina de células dispersas se extiende sobre un área fija, el área a ser evaluada es pequeña y su análisis toma menos tiempo que un frotis convencional
  • La tasa de frotis insatisfactorios disminuye
  • Las muestras LBC son adecuadas para otras pruebas tales como pruebas para VPH
  • Las láminas LBC son adecuadas para análisis automatizado

Desventajas de LBC

  • Los patrones del frotis se alteran debido a la selección aleatoria de células
  • Las células anormales se encuentran dispersas
  • Preparaciones escasas de LBC pueden ser difícil de examinar e interpretar
  • Aun se encuentran sangre, inflamación, moco y diátesis maligna pero aparecen ligeramente diferentes
  • Las células epiteliales aparecen principalmente como células individuales y son ligeramente más pequeñas que en los frotis convencionales especialmente las células endocervicales y las células metaplásticas inmaduras
  • LBC es más costoso que la prueba convencional

Lo adecuado de las muestras LBC

En todos los estudios publicados en el Reino Unido, la tasa de frotis inadecuados se reduce con la introducción de LBC, a pesar que los resultados de estudios internacionales muestran tasas variables. Este ha sido el factor más importante al considerar si el Reino Unido debería convertir sus preparaciones convencionales de Pap a LBC. Un punto importante a considerar es si la reducción de la tasa de casos inadecuados es segura. ¿Estamos convirtiendo frotis inadecuados a negativos adecuados o estamos perdiendo más frotis anormales mediante esta reducción? Es claro que se necesita más trabajo en los criterios para determinar si un frotis con la preparación LBC es adecuado. Se ha reconocido que los criterios actuales para definir si una muestra convencional con Pap es adecuada están sujetos a variación entre laboratorios, resultando en pobre estandarización de esta categoría diagnóstica

Los criterios Bethesda para determinar lo adecuado de las muestras de LBC

  • Cualquier muestra con células anormales es por definición satisfactoria para su evaluación
  • Un mínimo de 5000 células escamosas bien visualizadas/preservadas deben ser vistas en la lámina
  • Un mínimo de 10 campos visuales deben ser contados usualmente con el objetivo de x 40 a lo largo del diámetro que incluye el centro de la preparación
  • Las láminas con menos de 5000 células deben ser examinadas para determinar la razón
  • El número promedio de células por campo microscópico para alcanzar las 5000 células es mostrado a continuación. Si hay áreas hipocelulares o vacías en la preparación el porcentaje de áreas hipocelulares debe ser estimado
Guidelines for estimating the cellularity for Liquid Based Cytology slides (Ref. The Bethesda System 2001)
View rapid method of evaluating cellularity 1
View rapid method of evaluating cellularity 2

La modificación de la morfología celular con LBC

Los efectos principales de LBC en la morfología de las células epiteliales en las muestras son:

  • Pérdida de la relación entre las células y la dispersión aleatoria de células
  • Dispersión de células anormales
  • Monocapas escasas pueden ser difíciles de examinar e interpretar

Estos son ilustrados en las siguientes láminas

Patrón General del Frotis

The overall smear pattern is eliminated – but cell architecture and contextual background similar to that found in a conventional smear. The background pattern is cleaner than in conventional smears making it easier to identify normal and abnormal cells. Blood mucous inflammatory exudate and necrotic debris can still be recognised although they look a little different from conventional smears; the so called “tumour diathesis” can still be recognised in LBC preparation.
Inadequate LBC
Adequate LBC

 

Squamous epithelial cells

The general morphology of epithelial cells is preserved although they mainly appear as single cells. Clumps and sheets of epithelial cells are generally smaller than those seen in conventional smears Endocervical and immature metaplastic cells may appear slightly smaller.The chromatin may appear more granular but should show an even distribution.The nuclear membrane is usually smooth but may be folded

 

Endocervical cells

The typical honeycomb appearance can still be seen but isolated cells and cells in palisade also found. Bare nuclei less frequent in LBC preparations.Nuclei appear crisper and chromatin more granular.Cilia and mucous vacuoles in the cytoplasm may also be seen. Occasionally the cells may be rounded up or twisted due to processing artifact.

 

Immature metaplastic cells

Immature metaplastic  cells may appear smaller in LBC preparations giving the false impression of increased nuclear cytoplasmic ratio. However the smooth nuclear outline, even granular chromatin , occasional small round nucleolus and dense cytoplasm will confirm the benign nature of these cells.

 

En las preparaciones de LBC las células endometriales se encuentran frecuentemente bien preservadas a diferencia de los frotis convencionales donde estas aparecen a menudo degeneradas. Las células endometriales se ven en grupos tridimensionales o en bolas de células pero también pueden aparecer como células aisladas. Los núcleos son redondos u ovales, pequeños, uniformes e hipercromáticos. Debido a que la sangre sufre disrupción en las muestras LBC los frotis menstruales contienen solo el esbozo de eritrocitos. Se pueden ver histiocitos y restos celulares.

  • La sangre sufre lisis celular por lo tanto solo esbozos de eritrocitos pueden ser vistos en las muestras menstruales
  • La células se encuentran en grupos tridimensionales transparentes
  • Se pueden apreciar mejor la cromatina granular y las convoluciones de membrana

Embarazo

Immature metaplastic  cells may appear smaller in LBC preparations giving the false impression of increased nuclear cytoplasmic ratio. However the smooth nuclear outline, even granular chromatin , occasional small round nucleolus and dense cytoplasm will confirm the benign nature of these cells.

 

LBC image library

Candida
Candida
Clue cell
Endometrial cells
HSIL
HSIL
HSIL
HSIL
HSIL
HSIL
HSIL
Hyperkeratosis
Hyperkeratosis
Hyperkeratosis
Borderline ASCUS
Borderline ASCUS
Borderline ASCUS
Normal squamous epithelium
Degenerative effect of inflammation
Degenerative effect of inflammation
Degenerative effect of inflammation

 

Evaluación de LBC en Inglaterra - Estudios piloto

  • En Junio del 2000, el Instituto Nacional para la Excelencia Clínica (NICE) emitió guías para el uso de citología en base líquida para screening cervical.
  • Este indicó que LBC podía aportar beneficios importantes pero la calidad de la evidencia disponible era variable y existían algunas áreas de incertidumbre.
  • Se propuso un programa de implementación de proyectos piloto de LBC con revisión completa de resultados en cada etapa.
  • Estos proyectos buscaban evaluar todos los efectos, costos e implicaciones prácticas de la introducción de LBC en el programa de screening cervical.
  • Los productores de dos sistemas, ThinPrep® (Cytyc® Corporation, Marlborough, MA, USA) and SurePath T (Tripath Imaging® Inc., Burlington, NC, USA) aplicaron para los proyectos piloto, se usaron tres sitios, en dos con ThinPrep y en uno con SurePath.
  • Los proyectos piloto se llevaron a cabo en 2001 y 2002, 250.000 muestras fueron examinadas (y cerca de 12500 exámenes para VPH se realizaron). Los resultados fueron comparados con el periodo inmediatamente anterior usando el sistema convencional.
  • Se incluyeron los efectos en costos de laboratorio incluido equipo, bienes consumibles y productividad del personal así como la evaluación del costo efectividad de la priorización con pruebas del VPH y el efecto psicológico en mujeres con frotis inadecuados y pruebas del VPH positivas.

Resultados del Estudio Piloto de LBC en Inglaterra - cont.

  • La introducción de LBC redujo claramente el número de frotis inadecuados (de 9% a 1-2%). El ratio de frotis inadecuados en el estudio piloto fue más bajo en el sitio que usaba SurePath que en aquellos que usaban ThinPrep.
  • No había evidencia clara de impacto de LBC en la tasa de detección de frotis limítrofes (borderline) o de discariosis leve o de un impacto general en todos los sitios en las tasas de discariosis moderada y severa.
  • Durante los primeros dos meses de los estudios piloto, se vio cierta evidencia de efecto "curva de aprendizaje", con mayores tasas de frotis borderline y de casos de discariosis leve o moderada.
  • Había una reducción en la tasa de frotis reportados con neoplasia glandular
  • No es posible estimar la sensibilidad directamente de los estudios piloto, pues para ello se requiere conocimiento de resultados de screening falsos negativos. Sin embargo, los resultados en las tasas de discariosis moderada y severa y los resultados provisionales de el valor predictivo positivo sugieren que, para todos los sitios combinados, la sensibilidad no es menor con LBC que con citología convencional.
  • La productividad de los laboratorios aumentó con LBC porque se puede hacer más screening primario de láminas por hora; El número de descansos formales permaneció igual.
  • La reducción del número de frotis inadecuados utilizando LBC reduce los costes generales de screening pues menos frotis requieren ser tomados, preparados y leídos. Por ejemplo, con una reducción de casos inadecuados de 9% a 1.6%, un laboratorio que previamente procesaba 30.000 láminas al año, tendría una reducción de 2.220 láminas al año. A nivel nacional, la carga de trabajo se reduciría de 4,2 millones de láminas al año a 3,9 millones de láminas al año.
  • Evaluación de LBC en otros países
  • Los programas nacionales de screening cervical son complejos y multidisciplinarios. Diferentes países tienen diferentes intervalos y estrategias de screening. Así los efectos de la introducción de LBC serán diferentes. Australia 12, Nueva Zelanda 3, Alemania 11, Francia 7, y Holanda 20, y Escocia 8 han evaluado recientemente LBC y han llegado a diferentes conclusiones.
  • Escocia está implementando LBC
  • Australia y Nueva Zelanda han decidido no apoyar LBC con recursos públicos en este momento.
  • La sociedad alemana de citología ha recomendado mayores estudios, y el reporte francés no ha sido aún publicado.
  • Debido a que los patrones de frotis se alteran en las preparaciones LBC, el entrenamiento en la interpretación de estos frotis es esencial antes de comenzar el screening en estas muestras.
  • Las compañías comerciales ofrecen actualmente un curso de entrenamiento de 3 días.
  • El objetivo del programa es entrenar a los entrenadores.
  • Se espera que los citólogos que participen regresen a sus laboratorios a enseñar a la totalidad del personal del laboratorio.
  • Para los citotecnólogos, el objetivo es alcanzar 95% de sensibilidad en HSIL antes de realizar screening de rutina en láminas LBC.

 Cambios en la práctica laboral (evaluación de LBC en Inglaterra) - cont.

  • La preparación de muestras usando LBC está basada en máquinas que preparan de 25.000 a 80.000 muestras por año. Modelos propuestos para la modernización de la patología basados en redes administradas se adecuaría bien con máquinas de este tamaño, permitiendo la centralización en el procesamiento de muestras con la lectura y elaboración de informes en los hospitales donde el personal de screening está ubicado actualmente.
  • El sistema automatizado de screening aprobado por la FDA está actualmente disponible para muestras convencionales Pap 13, y si se aplicara a la práctica del Reino Unido, podría reducir significativamente la carga de trabajo y el trabajo acumulado en el laboratorio.

LBC y el screening VPH

  • Los resultados de la introducción de la priorización basados en resultados de pruebas del VPH lleva a una reducción de un 72% en la tasa de frotis que se repiten, y más del doble de las tasas de casos remitidos a colposcopia en estas mujeres comparado con la política actual.
  • Considerando la falta de evidencia concluyente en la sensibilidad del análisis de AND del VPH en el Reino Unido y del impacto en las remisiones a colposcopia observadas en los estudios piloto se recomienda prudencia en la implementación de pruebas del VPH para la priorización de mujeres, a pesar de los resultados prometedores de costo-efectividad actuales.

Conclusiones

  • La evidencia a la fecha sugiere, que las razones principales para introducir LBC son el incremento de la productividad en el programa de screening, mediante la reducción de casos inadecuados y el incremento de la productividad del laboratorio y el potencial futuro para la automatización y las pruebas auxiliares (a pesar que las últimas no dependen de su uso).
  • El Colegio tiene reservas en cuanto a la evidencia disponible en la sensibilidad y lo adecuado de las muestras (lo que afectarían la productividad).
  • Se debe tener en cuenta que LBC no ha sido probada en ningún estudio longitudinal en países con programas de screening de 3 a 5 años.
  • Es esencial que LBC no sea sobrestimado como método más sensitivo que el actual
  • Los retos mayores de entrenamiento deben ser adecuadamente financiados. Se requiere el mantenimiento de la experiencia en frotis convencionales Pap.
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