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Ανοσοκυτταροχημεία

Παράρτημα

1) Esposti’s ???????

???????? ????:

100 ml ??????????? ????
45 ml ????????
10 ml ??????????? ????? ???
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2) ?????????? ???????????

0.01M ???????????? ???? ?? ??????? ?????????? ??????  (PBS), pH 7.2 -7.4.

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?????????????

????????? ??????, 8.7g
???????? ????????? ?????, 0.272g
????? ????????? ????????, 1.136g
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????? ????????? ????????.2H2O, 1.41g
?
????? ????????? ????????.12 H2O, 2.83g

???????

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0.05M Tris-buffered saline (TBS)

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????????? ??????, 8.7g
???????????? ??????????? ???

???????

???????? ?? ????? ?? 900 ml ???????????? ? ???????????? ?????. ????????? ???????????? HCl ??? ???? ?? pH ????? 7.6. ???????????? ??? 1 L ?? ????.

 

3) ???????? ???????????

PBS (???? ????????) ???????? 0.1% ????????? ?????? ???? n ??? 0.1% ?????? ???????

 

4) ?????????? ???????????

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5) ??????????? ??????????? ?????????? ?????????????

??????????? ??? ????????? ?? ????????/PBS ??????????? ??? ????????????? ??????????????.

?????????????

30% ??????????? ?????????, 1 ml
70% ???????? ?? PBS, 100 ml
(0.3% ??????????? ?????????)

???????

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6) ?????-????????? ???????? ?????????

0.01M ??????? ?????????? ???????, pH 6.0

??? 2 ?????:

?????????????

??????? ???, 3.8g
2 M ?????????? ??????? (8% aq)

???????

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T? ?????????? ??????? ?????? ?? ??????????? ?? ??????????? ???????? ??? ??????? ?????? ? ?? ???????????? ??? ?????? ????? 4°C.

Tris/EDTA ?????????? ???????, pH9.0

?????????????

???  1 ????? (10 ????? ????????????)
????(???????????)??????????,  12 g
Ethylene-diamine tetra-acetic acid, disodium salt, dehydrate, 1 g
1 M ??????????? ???, ??????? 500 ml
????, 500 ml

???????

???????? ?? ????? ??? ????.
????????? ?? ??????????? ???, ???????? ??? ??????? ?? pH ??? pH 9.0
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7) ??????? ????????????????? ??? ???????? ????????????? (Pelliniemi et al, 1965)

??????? ???????:

?????????????

3,3’-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) (e.g. Sigma-Aldrich D5637)  50 mg
PBS 100 ml
??????????? ????????? (30%), 30 µl (?????? ??????????? 0.03%)

DAB ?????? ?? ??????????? ?? ????????? ? ?? ????????? ??? ???????? ??? ?????????? ???????. ??? ?????????? ?? ????????????? ?? ???? ???, ????????  ????????? 5g ? 25 g ??? ????????? ?? ???????? ?? ?????, ???????? ??? ?? ???????? ?? ??????????? ???? ??? ??? ????????? ???? ?????????? ??? ???????? 50 mg DAB/ml. ???????? (?? ???????) ??? 15 ????? ?? ??? ???????, ?????? ????????? ?? ???????? ??? ????????? ??? ????????? ???? ??? ?? ???? ??? ?????. ??? ??????????, ???????? ??? 5 ml ??? ??? ????????? 500 ml ? ???????? ??? 1 ml ??? ??? ????????? 100 ml ??????? 0.05% ?????????? ???????. ??????? ?? ???????? ??? ???????????? ?? ?? ????????? -20°C ??? ??????????. ??? ?????, ????????? ??? ???????? ??? ????????? DAB ???? ????????? ???? PBS. ????????? ??????????? ????????? ??? ??? ????????? 0.03%, ???????? ???? ??? ??????? ??? ???????????????? ?????? ??? 10 ?????. ????????? ?? PBS ??? ?????? ?? ????, ??? ?????????? ?? ??? ???????? ?????.

??????? ???????? DAB

DAB ?????? ?? ???????????? ??????? ?? ??? ??????? ??????? ?????????. ????? ???????? ??????????? ??? ??? ?? ?????? ?? ???????????? ??? ??????? ??????????? ??? ?????.

8) ?????????????????? ?????????? ?????? – ??????????? ???????

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N.B. ?????? 1 ??? 2 ??????? ?? ???????????????? ??? ?? ?????????? ????? ??? ??????????.

TBS ?????? ?? ?????????????? ??? PBS ?????? ?? ?????????? ??? ??????????.

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  2. ???????? ????????? ??? ????????
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  4. ????????? ??? ??????????????? ????? ????? ??? ??? ??????? ??? ???????????????. ???????????? ?????? ??? ??????????? ?????????? ??????? ???????? ??? ?? ???????????? (??? ??? ??????? ???????? ??? ??????????? ??? ?? ????????? ???? ????????) ??? ??????????? ??? ? ?????? ???????? ????? ???????. ????????????????? ??? ???????????????? ?????? ??? ???? ???? ?????? ?? ??? ??????? ??? ????????? ????????? ????????? ?????????? ????????. ? ??????? ???????? ??? ????? ????????? ???? ?? ???????? ?????? ?? ??????? ??? ??????? ??? ???????????????. ??????????? ?? ?? ???????????? ??????? ??????? (positive control) (??? ??? ???? ??? ??? ?? ?????????? ??? ????????????????) ??? ??? ???????????? ????????? ??????? (negative control) (??? ??? ???? ??????????? ??? ?????????)  ??????????????? PBS ???? ??? ?????????? ????????. ????????????????? ?? ?????? ??? ?????? ?? ????? ? ?????? ??? 1 ??? ?? ??????????? ???????? ? overnight ????? 4°C ??????? ?? ?? ???????????????? ??????????.
  5. ????????? ?????? ?? ?????????? ???????? ?? ???????????? ??? ???????????????? ?????? ??? ???? ??? PBS. ????????? ?? 3 ??????? PBS ??? 5 ????? ? ???????.
  6. ????????? ??? ???????????????? ?????? ???? ??? ???? ??? ???????????? ??? ?????? ?? ??? ??????? (?? ??????????? ????????). ????????? ?? ??????????? ??????????? ?????????? (????-????????? Ig ? ????-????? (? ???? ????) Ig ?? ???????? ??????? ??? 30 ????? ? ???? ??????????? ??? ??? ??????? ??? ????????????. ???????? kits ???????? ??? “universal” ???????????? ???????? ??? ?? ?????????? ?? ??? ?????????????? ???? ??? ????? ??? ??? ??? ????????.
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    ??? “home-made” ??????? ????????? ??? ?????????)
  8. ???????????? ?????? ?? DAB (??? ?????? ???????? ??? ?????????? DAB, ??? ?????????)
    ????????? ??? ???????????????? ?????? ?? PBS ??? ?????? ?? ?????????? ????. ??????? ??????????? ??????? ?? ???????????? ?? ??? ?????? ?????, ??????????????? ??? ????? ??????? ??? “blueing” ??? ?????????. ?????????? ???? ?????????????? ????????, ????????? ?? ?????? ??? ??????? ?? ????? ??????? ??? ????????? ??????.

 

9) ???-???????????????? ??????? ??  Sequenza™ ??????

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???? ?????? ?? ???????? ??????? 100 µl ?????????? ??????????? ??? ??????????????? ?????.

? ???????? ??? ????????????? ??? ? ???????? ????? (??????????????? Mayer’s Haemalum, ??? ??? ?????????? ?????????????) ??????? ?? ?????? ???? ?? ?????? Sequenza, ????? ?? ????????? ??????? ???????? ??????? ???? ???????????. ????????? ?? ????????????? ????????? ???? ?????? ?? ??? ???? ????? ???? ?? ?? ??????????????? ??????? DAB ??? ??????????? ??????.

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??? ?? ??????????? ??????????????? ?? ?? DAB, ??????????? ??? ?? ???? ??? ????? ???? ????????? ??????? (???????????? ??????) overnight. ?????? ??????? ?? ??? ??????? ?? ???? ????????? ??? ??????????? ?? ?????????????. ?????????  ?? ??????????? ? ??????????? ???? ??? ??????????? ????????? ?? ?????????? ???? ????????????????? ??? ????? ??????????? ????.

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