1) Esposti’s Διάλυμα

Αναμίξτε μαζί:

100 ml απιονισμένο νερό
45 ml μεθανόλη
10 ml κρυσταλλικό οξικό οξύ
Αποθηκεύστε σε θερμοκρασία δωματίου

2) Ρυθμιστικά διαλύματατα

0.01M φυσιολογικός ορός με διάλυμα φωσφορικών ιόντων  (PBS), pH 7.2 -7.4.

Αυτό το ρυθμιστικό διάλυμα μπορεί να παρασκευαστεί από έτοιμες ταμπλέτες (διασφαλίστε ότι η μοριακότητα και το pH είναι σωστά) ή παρασκευάζονται με ακόμη μικρότερο κόστος από το εργαστήριο.

Αντιδραστήρια

Χλωριούχο νάτριο, 8.7g
Δισόξινο φωσφορικό κάλιο, 0.272g
όξινο φωσφορικό δινάτριο, 1.136g
ή
όξινο φωσφορικό δινάτριο.2H2O, 1.41g
ή
όξινο φωσφορικό δινάτριο.12 H2O, 2.83g

Μέθοδος

Διαλύστε τα άλατα ξεχωριστά σε απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό (φωσφορικό νάτριο διαλύεται ευκολότερα σε ζεστό νερό) έπειτα αναμίξτε, σε αναλογία 1: l και ελέγξτε το pH.
Ένα 10-φορές συμπυκνωμένο διάλυμα μπορεί να παρασκευαστεί (0.1M) και να αραιωθεί με νερό προς χρήση. Το pH του θα πρέπει να ελεγχθεί κατά την αραίωση καθόσον το pH του συμπυκνωμένου θα είναι διαφορετικό.
Αποθηκεύστε σε θερμοκρασία δωματίου.

0.05M Tris-buffered saline (TBS)

Αντιδραστήρια

Τρις(υδροξυμεθυλ)μεθυλαμίνη  6.07g
Χλωριούχο νάτριο, 8.7g
Συμπυκνωμένο υδροχλωρικό οξύ

Μέθοδος

Διαλύστε τα άλατα σε 900 ml απεσταγμένου ή απιονισμένου νερού. Προσθέστε συμπυκνωμένο HCl έως ότου το pH γίνει 7.6. Παρασκευάστε έως 1 L με νερό.

3) Διαλύτης αντισωμάτων

PBS (όπως παραπάνω) περιέχει 0.1% αλβουμίνη βόειου ορού n και 0.1% αζίδιο νατρίου

4) Αποθήκευση αντισωμάτων

Πολλά αντισώματα μπορούν να διατηρηθούν για μεγάλες περιόδους σε διαλύτη στους 4°C αλλά το διάλυμα θα πρέπει να ελέγχεται κατά διαστήματα για την ανοσοαντιδραστικότητα του. Φυσιολογικός ορός για αποκλεισμό μπορεί επίσης να αποθηκευτεί σε αυτό το διάλυμα.

Μην χρησιμοποιείτε διαλύτη για υπεροξειδάση-σεσημασμένα αντισώματα καθώς το ένζυμο αναστέλλεται από το αζίδιο νατρίου. Χρησιμοποιείστε μόνον  PBS για την αραίωση και να μην αποθηκεύετε αραιωμένο αντίσωμα.

ρισσότερο μη σεσημασμένα αντισώματα μπορούν να αποθηκευτούν στην κατάψυξη στους  -20°C, αλλά η διαίρεση του στοκ σε κατάλληλα μικρότερα κλάσματα πριν την ψύξη θα εμποδίσει τη συνεχή κατάψυξη και ξεπάγωμα. Ταχεία κατάψυξη και ξεπάγωμα μίας φοράς προτιμάται. Εάν είναι εφικτό, γίνεται ταχεία ψύξη των κλασμάτων σε υγρό άζωτο πριν την τοποθέτηση στην κατάψυξη. Μην καταψύξετε τα διαλύματα αντισωμάτων σε μεγαλύτερη αραίωση από 1/100.

Κάποια αντισώματα παρέχονται αραιωμένα 1:1 σε γλυκερόλη. Αυτό αποτρέπει την δημιουργία πάγου και το στοκ μπορεί να τοποθετηθεί εντός και εκτός του καταψύκτη χωρίς αλλοίωση. Η αραίωση θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη κατά την προετοιμασία του διαλύματος εργασίας.

5) Αποκλεισμός ενεργότητας ενδογενούς υπεροξειδάσης

Υπεροξείδιο του υδρογόνου σε μεθανόλη/PBS προτείνεται για κυτταρολογικά παρασκευάσματα.

Αντιδραστήρια

30% υπεροξείδιο υδρογόνου, 1 ml
70% μεθανόλη σε PBS, 100 ml
(0.3% υπεροξείδιο υδρογόνου)

Μέθοδος

Παρασκευάστε το διάλυμα H2O2 ακριβώς πριν τη χρήση. Εμβαπτίστε τα παρασκευάσματα για 30 λεπτά και μετά ξεπλύνετε με  PBS. 

6) Θερμο-επαγόμενη ανάκτηση αντιγόνου

0.01M κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα, pH 6.0

Για 2 λίτρα:

Αντιδραστήρια

Κιτρικό οξύ, 3.8g
2 M υδροξείδιο νατρίου (8% aq)

Μέθοδος

Διαλύστε το κιτρικό οξύ σε 1.9 λίτρα νερού
Προσθέστε το διάλυμα υδροξειδίου νατρίου (ανάδευση) έως ότου το pH γίνει  6.0.(20-30 ml θα χρειαστούν). Παρασκευάστε έως 2:l με νερό.
Tο ρυθμιστικό διάλυμα πρέπει να διατηρείται σε θερμοκρασία δωματίου για αρκετές ημέρες ή να αποθηκεύεται στο ψυγείο στους 4°C.

Tris/EDTA ρυθμιστικό διάλυμα, pH9.0

Αντιδραστήρια

Για  1 λίτρο (10 φορές συμπυκνωμένο)
Τρις(υδροξυμεθυλ)μεθυλαμίνη,  12 g
Ethylene-diamine tetra-acetic acid, disodium salt, dehydrate, 1 g
1 M υδροχλωρικό οξύ, περίπου 500 ml
Νερό, 500 ml

Μέθοδος

Διαλύστε τα άλατα στο νερό.
Προσθέστε το υδροχλωρικό οξύ, αναμίξτε και ελέγξτε το pH έως pH 9.0
Το ρυθμιστικό διάλυμα είναι 10 φορές συμπυκνωμένο. Αποθηκεύστε στους 4°C και αραιώστε εφόσον χρειαστεί.

Μέθοδος φούρνου μικροκυμάτων*

Χρησιμοποιείστε έναν οικιακό φούρνο μικροκυμάτων με περιστρεφόμενο πιάτο

1. Τοποθετήστε στον φούρνο μικροκυμάτων 400 ml ρυθμιστικού διαλύματος σε ένα καλυμμένο πλαστικό δοχείο μαζί με 200 ml απεσταγμένου νερού σε ένα πλαστικό ποτήρι ζέσεως. Θερμάνετε για 2 λεπτά στα 750 W. Τα διαλύματα θα πρέπει να αποκτήσουν θερμοκρασία 40 – 60°C. Αφαιρέστε το νερό και διατηρείστε το για συμπλήρωση της στάθμης του υγρού.
2. Τοποθετείστε μέσα στο ρυθμιστικό διάλυμα την πλαστική βάση με τα παρασκευάσματα, διασφαλίζοντας ότι οι αντικειμενοφόρες πλάκες έχουν καλυφθεί. Τοποθετήστε ένα καπάκι στο δοχείο ή καλύψτε χαλαρά με “cling-film”. Σημειώστε τη στάθμη του υγρού στο δοχείο.
3. Θερμάνετε στα 750 W για 5 λεπτά. Το διάλυμα πρέπει να βράσει.
4. Ελέγξτε τη στάθμη του υγρού και συμπληρώστε μέχρι την σημειωμένη αρχική στάθμη με ζεστό απεσταγμένο νερό εάν χρειαστεί (προσέξτε για ατμούς κατά την απομάκρυνση του καπακιού του δοχείου).
5. Eπαναλάβετε τα στάδια 3 και 4 για το απαιτούμενο χρονικό διάστημα – συνήθως 10 έως 30 λεπτά αλλά αυτό εξαρτάται από το κάθε αντιγόνο.**
6. Χρησιμοποιείστε μονωμένα γάντια, μεταφέρετε το δοχείο σε ένα νεροχύτη και προσεκτικά αφαιρέστε το καπάκι. Προσθέστε κρύο νερό μέχρις ότου η βάση με τις αντικειμενοφόρες πλάκες να μπορεί να απομακρυνθεί χωρίς κίνδυνο κρυστάλλωσης του ρυθμιστικού διαλύματος πάνω στα παρασκευάσματα. Ξεπλύνετε με νερό βρύσης, έπειτα τοποθετείστε σε PBS.
7. Ξεπλύνετε με νερό και μεταφέρετε στο PBS και συνεχίστε με την ανοσοκυτταροχημική μέθοδο χρώσης.

*Υπάρχουν πολλοί μέθοδοι οργάνωσης HIER. Αυτή  είναι η μία που χρησιμοποιείται από το εργαστήριο των συγγραφέων.

**Εάν τα παρασκευάσματα είναι ανοσοκυτταροχημικά βαμμένα για αντιγόνα που απαιτούν διαφορετικά χρονικά διαστήματα θέρμανσης στην ίδια πειραματική ανάλυση, ξεκινήστε με εκείνα που απαιτούν το μεγαλύτερο διάστημα έπειτα προσθέστε τα υπόλοιπα στα κατάλληλα στάδια. Αυτό αποτρέπει το να πρέπει να αφαιρεθούν οι αντικειμενοφόρες πλάκες από το καυτό διάλυμα που οδηγεί σε κατακρήμνιση των αλάτων του ρυθμιστικού διαλύματος πάνω στο παρασκεύασμα.

7) Διάλυμα διαμινοβενζιδίνης για ανάπτυξη υπεροξειδάσης (Pelliniemi et al, 1965)

Διάλυμα επώασης:

Αντιδραστήρια

3,3’-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) (e.g. Sigma-Aldrich D5637)  50 mg
PBS 100 ml
Υπεροξείδιο υδρογόνου (30%), 30 µl (τελική συγκέντρωση 0.03%)

DAB μπορεί να προμηθευτεί σε ταμπλέτες ή σε διαλύματα για προσθήκη στο ρυθμιστικό διάλυμα. Εάν επιθυμείτε να παρασκευάσετε το δικό σας, αγοράστε  ποσότητες 5g ή 25 g και αποφύγετε να ζυγίσετε τη σκόνη, διαλύστε όλη τη ποσότητα σε απεσταγμένο νερό για την παρασκευή ενός διαλύματος που περιέχει 50 mg DAB/ml. Αναμίξτε (με κάλυμμα) για 15 λεπτά σε ένα απαγωγό, έπειτα διανέμετε σε φιαλίδια που περιέχουν τον κατάλληλο όγκο για τη δική σας χρήση. Για παράδειγμα, κλάσματα των 5 ml για την παρασκευή 500 ml ή κλάσματα του 1 ml για την παρασκευή 100 ml τελικού 0.05% διαλύματος επώασης. Κλείστε τα φιαλίδια και τοποθετείστε τα σε καταψύκτη -20°C για αποθήκευση. Για χρήση, ξεπαγώστε ένα φιαλίδιο και προσθέστε DAB στον κατάλληλο όγκο PBS. Προσθέστε υπεροξείδιο υδρογόνου για την παρασκευή 0.03%, αναμίξτε καλά και επωάστε τις αντικειμενοφόρες πλάκες για 10 λεπτά. Ξεπλύνετε σε PBS και έπειτα σε νερό, και προχωρήστε με την πυρηνική χρώση.

Ασφαλής απόρριψη DAB

DAB πρέπει να απορρίπτεται σύμφωνα με τις τοπικές οδηγίες ασφαλείας. Είναι δυνητικά καρκινογόνο και δεν θα πρέπει να απορρίπτεται στο σύστημα αποχέτευσης του νερού.

8) Ανοσοκυτταροχημική διαδικασία χρώσης – χειροκίνητη μέθοδος

Μονιμοποιημένο κυτταρολογικό παρασκεύασμα σε αντικειμενοφόρο πλάκα, PEG (εφόσον χρησιμοποιείται) αφαιρείται σε 2 αλλαγές 95% μεθανόλης. Συμπεριλαμβάνετε αντικειμενοφόρο πλάκα θετικού ελέγχου (positive control) και αρνητικού ελέγχου (negative control) για τη δοκιμασία.

N.B. Στάδια 1 και 2 μπορούν να πραγματοποιηθούν και με αντίστροφη σειρά εάν προτιμάται.

TBS μπορεί να αντικατασταθεί από PBS καθόλη τη διαδικασία εάν προτιμάται.

1. Αποκλεισμός ενζύμων που ομοιάζουν την ενδογενή υπεροξειδάση
   Εμβαπτίστε τις αντικειμενοφόρες πλάκες σε 0.3% υπεροξείδιο υδρογόνου σε 70% μεθανόλη σε PBS (1 ml από 30% H₂O₂ σε 100 ml 70 % μεθανόλη σε PBS) για  30 λεπτά. Ξεπλύνετε ελαφρώς σε PBS.
2. Ανάκτηση αντιγόνου δες παραπάνω
3. Λάβετε μέριμνα ώστε το παρασκεύασμα να μην αποξηρανθεί, σκουπίστε τη στρόγγυλη περιοχή του παρασκευάσματος, ζωγραφίστε ένα κύκλο γύρω από αυτό με ειδικό στυλό, τοποθετείστε σε βάση σε θάλαμο με υγρασία και προσθέστε τον ορό αποκλεισμού υποβάθρου (φυσιολογικός ορός από είδη που παράγουν το δευτερογενές αντίσωμα, αραιωμένος 1/10 σε διαλύτη αντισωμάτων). Καλύψτε τον θάλαμο επώασης και αφήστε τον για 10 λεπτά. Απομακρύνετε πλήρως τον ορό και ξεπλύνετε ελαφρώς σε PBS.
4. Σκουπίστε την αντικειμενοφόρο πλάκα εκτός από την περιοχή του παρασκευάσματος. Απομακρύνετε πλήρως όσο περισσότερο ρυθμιστικό διάλυμα μπορείτε από το παρασκεύασμα (για την αποφυγή αραίωσης του αντισώματος που θα προστεθεί στην συνέχεια) και διασφαλίστε ότι ο κύκλος σήμανσης είναι στεγνός. Επανατοποθετείστε τις αντικειμενοφόρες πλάκες στη βάση στον θάλαμο με την υγρασία και προσθέστε κατάλληλα αραιωμένο πρωτογενές αντίσωμα. Η ακριβής ποσότητα δεν είναι σημαντική αλλά το αντίσωμα πρέπει να καλύψει την περιοχή του παρασκευάσματος. Επαναλάβετε με το παρασκεύασμα θετικού ελέγχου (positive control) (ένα για κάθε ένα από τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται) και ένα παρασκεύασμα αρνητικού ελέγχου (negative control) (ένα για κάθε περιστατικό που αναλύεται)  χρησιμοποιώντας PBS αντί για πρωτογενές αντίσωμα. Επανατοποθετείστε το καπάκι και αφήστε να γίνει η επώαση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου ή overnight στους 4°C σύμφωνα με τη βελτιστοποιημένη διαδικασία.
5. Αφαιρέστε πλήρως το πρωτογενές αντίσωμα κα τοποθετείστε τις αντικειμενοφόρες πλάκες στη βάση στο PBS. Ξεπλύνετε με 3 αλλαγές PBS για 5 λεπτά η καθεμία.
6. Σκουπίστε τις αντικειμενοφόρες πλάκες όπως και πριν και τοποθετείστε στο θάλαμο με την υγρασία (σε θερμοκρασία δωματίου). Προσθέστε τα σεσημασμένα δευτερογενή αντισώματα (αντι-ποντικιού Ig ή αντι-λαγού (ή άλλα είδη) Ig σε βέλτιστη αραίωση για 30 λεπτά ή όπως προτείνεται από τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ορισμένα kits παρέχουν ένα “universal” δευτερογενές αντίσωμα που θα αντιδράσει με τις ανοσοσφαιρίνες τόσο του λαγού όσο και του ποντικού.
7. Ξεπλύνετε με 3 αλλαγές PBS, έπειτα στεγνώστε τις αντικειμενοφόρες πλάκες και επανατοποθετείστε τις στο θάλαμο όπως και πριν. Αναπτύξτε την υπεροξειδάση σύμφωνα με τις οδηγίες του kit (συνήθως 5 με 10 λεπτά). Είναι σημαντικό να εφαρμόζετε πάντοτε ένα ομοιόμορφο χρονικό διάστημα ανάπτυξης, έτσι ώστε να συγκρίνεται η ένταση της ανοσοκυτταροχημικής χρώσης μεταξύ δειγμάτων και αντιγόνων .  N.B. Να φοράτε γάντια όταν χειρίζεστε το DAB – είναι δυνητικά καρκινογόνο.
   Για “home-made” διάλυμα ανάπτυξης δες παράρτημα)
9. Απομακρύνετε πλήρως το DAB (Για ασφαλή απόρριψη των διαλυμάτων DAB, δες παράρτημα)
   Ξεπλύνετε τις αντικειμενοφόρες πλάκες σε PBS και έπειτα σε τρεχούμενο νερό. Πυρήνες κεχρωσμένοι ελαφρώς με αιματοξυλίνη με τον συνήθη τρόπο, διαφοροποιώντας την όξινη αλκοόλη και “blueing” εάν χρειαστεί. Αφυδατώστε μέσω διαβαθμισμένης αλκοόλης, καθαρίστε σε ξυλόλη και καλύψτε σε υλικό κάλυψης από συνθετική ρητίνη.

9) Ημι-αυτοματοποιημένη μέθοδος με  Sequenza™ βάσεις

Αυτά τα στάδια της μεθόδου είναι τα ίδια με τη χειροκίνητη μέθοδο, εκτός του ότι τα στάδια 1 και 2 πιθανώς να γίνονται καλύτερα με αντεστραμμένη σειρά. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες τοποθετούνται σε βάσεις Sequenza μετά τα στάδια ανάκτησης αντιγόνου και αποκλεισμού ενδογενούς υπεροξειδάσης που έγιναν στις βάσεις. Τα στάδια πλύσης είναι για 5 λεπτά το καθένα και γίνονται με PBS που περιέχει 0.05% Tween 20. Αυτό είναι απορρυπαντικό που βοηθάει το ρυθμιστικό διάλυμα να κινηθεί ομαλά πάνω στην αντικειμενοφόρο πλάκα. Ο χώρος στην κορυφή μεταξύ της αντικειμενοφόρου πλάκας και της καλυπτρίδας γεμίζει με το ρυθμιστικό διάλυμα (από ένα μπουκάλι πλύσης) και χρειάζεται 3 με 5 λεπτά για τρέξει. Διασφαλίστε οπτικά ότι όλο το ρυθμιστικό διάλυμα έχει τρέξει πριν την προσθήκη διαλύματος αντισωμάτων αποφεύγοντας την αραίωση του.

Κάθε στάδιο με αντίσωμα απαιτεί 100 µl αραιωμένου αντισώματος ανά αντικειμενοφόρο πλάκα.

Η ανάπτυξη της υπεροξειδάσης και η πυρηνική χρώση (χρησιμοποιείστε Mayer’s Haemalum, που δεν χρειάζεται διαφοροποίηση) μπορούν να γίνουν πάνω σε βάσεις Sequenza, μόλις το κατάλληλο χρονικό διάστημα επώασης έχει τυποποιηθεί. Απορρίψτε τα εναπομείναντα διαλύματα στις βάσεις με τον ίδιο τρόπο όπως με το χρησιμοποιημένο διάλυμα DAB στη χειροκίνητη μέθοδο.

Μετά από αυτό το στάδιο, αφαιρέστε τον συνδυασμό αντικειμενοφόρου πλάκας/καλυπτρίδας από τη βάση, διαχωρείστε τα 2 κάτω από την επιφάνεια του νερού σε ένα τρυβλίο, τοποθετήστε σε μία βάση αντικειμενοφόρων πλακών και αφυδατώστε, καθαρίστε και καλύψτε ως συνήθως.

Εάν οι καλυπτρίδες αποχρωματιστούν με το DAB, τοποθετήστε τις σε νερό στο οποίο έχει προστεθεί χλωρίνη (Υποχλωριώδες νάτριο) overnight. Λάβετε μέριμνα να μην αφήσετε τη λεία επιφάνεια των καλυπτρίδων να γρατζουνιστεί. Ξεπλύνετε  με απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό και τοποθετήστε ξεχωριστά να στεγνώσουν πριν επανατοποθετηθούν στο κουτί αποθήκευσης τους.