Αναμίξτε μαζί:
100 ml απιονισμένο νερό
45 ml μεθανόλη
10 ml κρυσταλλικό οξικό οξύ
Αποθηκεύστε σε θερμοκρασία δωματίου
0.01M φυσιολογικός ορός με διάλυμα φωσφορικών ιόντων (PBS), pH 7.2 -7.4.
Αυτό το ρυθμιστικό διάλυμα μπορεί να παρασκευαστεί από έτοιμες ταμπλέτες (διασφαλίστε ότι η μοριακότητα και το pH είναι σωστά) ή παρασκευάζονται με ακόμη μικρότερο κόστος από το εργαστήριο.
Αντιδραστήρια
Χλωριούχο νάτριο, 8.7g
Δισόξινο φωσφορικό κάλιο, 0.272g
όξινο φωσφορικό δινάτριο, 1.136g
ή
όξινο φωσφορικό δινάτριο.2H2O, 1.41g
ή
όξινο φωσφορικό δινάτριο.12 H2O, 2.83g
Μέθοδος
Διαλύστε τα άλατα ξεχωριστά σε απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό (φωσφορικό νάτριο διαλύεται ευκολότερα σε ζεστό νερό) έπειτα αναμίξτε, σε αναλογία 1: l και ελέγξτε το pH.
Ένα 10-φορές συμπυκνωμένο διάλυμα μπορεί να παρασκευαστεί (0.1M) και να αραιωθεί με νερό προς χρήση. Το pH του θα πρέπει να ελεγχθεί κατά την αραίωση καθόσον το pH του συμπυκνωμένου θα είναι διαφορετικό.
Αποθηκεύστε σε θερμοκρασία δωματίου.
0.05M Tris-buffered saline (TBS)
Αντιδραστήρια
Τρις(υδροξυμεθυλ)μεθυλαμίνη 6.07g
Χλωριούχο νάτριο, 8.7g
Συμπυκνωμένο υδροχλωρικό οξύ
Μέθοδος
Διαλύστε τα άλατα σε 900 ml απεσταγμένου ή απιονισμένου νερού. Προσθέστε συμπυκνωμένο HCl έως ότου το pH γίνει 7.6. Παρασκευάστε έως 1 L με νερό.
PBS (όπως παραπάνω) περιέχει 0.1% αλβουμίνη βόειου ορού n και 0.1% αζίδιο νατρίου
Πολλά αντισώματα μπορούν να διατηρηθούν για μεγάλες περιόδους σε διαλύτη στους 4°C αλλά το διάλυμα θα πρέπει να ελέγχεται κατά διαστήματα για την ανοσοαντιδραστικότητα του. Φυσιολογικός ορός για αποκλεισμό μπορεί επίσης να αποθηκευτεί σε αυτό το διάλυμα.
Μην χρησιμοποιείτε διαλύτη για υπεροξειδάση-σεσημασμένα αντισώματα καθώς το ένζυμο αναστέλλεται από το αζίδιο νατρίου. Χρησιμοποιείστε μόνον PBS για την αραίωση και να μην αποθηκεύετε αραιωμένο αντίσωμα.
ρισσότερο μη σεσημασμένα αντισώματα μπορούν να αποθηκευτούν στην κατάψυξη στους -20°C, αλλά η διαίρεση του στοκ σε κατάλληλα μικρότερα κλάσματα πριν την ψύξη θα εμποδίσει τη συνεχή κατάψυξη και ξεπάγωμα. Ταχεία κατάψυξη και ξεπάγωμα μίας φοράς προτιμάται. Εάν είναι εφικτό, γίνεται ταχεία ψύξη των κλασμάτων σε υγρό άζωτο πριν την τοποθέτηση στην κατάψυξη. Μην καταψύξετε τα διαλύματα αντισωμάτων σε μεγαλύτερη αραίωση από 1/100.
Κάποια αντισώματα παρέχονται αραιωμένα 1:1 σε γλυκερόλη. Αυτό αποτρέπει την δημιουργία πάγου και το στοκ μπορεί να τοποθετηθεί εντός και εκτός του καταψύκτη χωρίς αλλοίωση. Η αραίωση θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη κατά την προετοιμασία του διαλύματος εργασίας.
Υπεροξείδιο του υδρογόνου σε μεθανόλη/PBS προτείνεται για κυτταρολογικά παρασκευάσματα.
Αντιδραστήρια
30% υπεροξείδιο υδρογόνου, 1 ml
70% μεθανόλη σε PBS, 100 ml
(0.3% υπεροξείδιο υδρογόνου)
Μέθοδος
Παρασκευάστε το διάλυμα H2O2 ακριβώς πριν τη χρήση. Εμβαπτίστε τα παρασκευάσματα για 30 λεπτά και μετά ξεπλύνετε με PBS.
0.01M κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα, pH 6.0
Για 2 λίτρα:
Αντιδραστήρια
Κιτρικό οξύ, 3.8g
2 M υδροξείδιο νατρίου (8% aq)
Μέθοδος
Διαλύστε το κιτρικό οξύ σε 1.9 λίτρα νερού
Προσθέστε το διάλυμα υδροξειδίου νατρίου (ανάδευση) έως ότου το pH γίνει 6.0.(20-30 ml θα χρειαστούν). Παρασκευάστε έως 2:l με νερό.
Tο ρυθμιστικό διάλυμα πρέπει να διατηρείται σε θερμοκρασία δωματίου για αρκετές ημέρες ή να αποθηκεύεται στο ψυγείο στους 4°C.
Tris/EDTA ρυθμιστικό διάλυμα, pH9.0
Αντιδραστήρια
Για 1 λίτρο (10 φορές συμπυκνωμένο)
Τρις(υδροξυμεθυλ)μεθυλαμίνη, 12 g
Ethylene-diamine tetra-acetic acid, disodium salt, dehydrate, 1 g
1 M υδροχλωρικό οξύ, περίπου 500 ml
Νερό, 500 ml
Μέθοδος
Διαλύστε τα άλατα στο νερό.
Προσθέστε το υδροχλωρικό οξύ, αναμίξτε και ελέγξτε το pH έως pH 9.0
Το ρυθμιστικό διάλυμα είναι 10 φορές συμπυκνωμένο. Αποθηκεύστε στους 4°C και αραιώστε εφόσον χρειαστεί.
Χρησιμοποιείστε έναν οικιακό φούρνο μικροκυμάτων με περιστρεφόμενο πιάτο
*Υπάρχουν πολλοί μέθοδοι οργάνωσης HIER. Αυτή είναι η μία που χρησιμοποιείται από το εργαστήριο των συγγραφέων.
**Εάν τα παρασκευάσματα είναι ανοσοκυτταροχημικά βαμμένα για αντιγόνα που απαιτούν διαφορετικά χρονικά διαστήματα θέρμανσης στην ίδια πειραματική ανάλυση, ξεκινήστε με εκείνα που απαιτούν το μεγαλύτερο διάστημα έπειτα προσθέστε τα υπόλοιπα στα κατάλληλα στάδια. Αυτό αποτρέπει το να πρέπει να αφαιρεθούν οι αντικειμενοφόρες πλάκες από το καυτό διάλυμα που οδηγεί σε κατακρήμνιση των αλάτων του ρυθμιστικού διαλύματος πάνω στο παρασκεύασμα.
Διάλυμα επώασης:
Αντιδραστήρια
3,3’-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) (e.g. Sigma-Aldrich D5637) 50 mg
PBS 100 ml
Υπεροξείδιο υδρογόνου (30%), 30 µl (τελική συγκέντρωση 0.03%)
DAB μπορεί να προμηθευτεί σε ταμπλέτες ή σε διαλύματα για προσθήκη στο ρυθμιστικό διάλυμα. Εάν επιθυμείτε να παρασκευάσετε το δικό σας, αγοράστε ποσότητες 5g ή 25 g και αποφύγετε να ζυγίσετε τη σκόνη, διαλύστε όλη τη ποσότητα σε απεσταγμένο νερό για την παρασκευή ενός διαλύματος που περιέχει 50 mg DAB/ml. Αναμίξτε (με κάλυμμα) για 15 λεπτά σε ένα απαγωγό, έπειτα διανέμετε σε φιαλίδια που περιέχουν τον κατάλληλο όγκο για τη δική σας χρήση. Για παράδειγμα, κλάσματα των 5 ml για την παρασκευή 500 ml ή κλάσματα του 1 ml για την παρασκευή 100 ml τελικού 0.05% διαλύματος επώασης. Κλείστε τα φιαλίδια και τοποθετείστε τα σε καταψύκτη -20°C για αποθήκευση. Για χρήση, ξεπαγώστε ένα φιαλίδιο και προσθέστε DAB στον κατάλληλο όγκο PBS. Προσθέστε υπεροξείδιο υδρογόνου για την παρασκευή 0.03%, αναμίξτε καλά και επωάστε τις αντικειμενοφόρες πλάκες για 10 λεπτά. Ξεπλύνετε σε PBS και έπειτα σε νερό, και προχωρήστε με την πυρηνική χρώση.
Ασφαλής απόρριψη DAB
DAB πρέπει να απορρίπτεται σύμφωνα με τις τοπικές οδηγίες ασφαλείας. Είναι δυνητικά καρκινογόνο και δεν θα πρέπει να απορρίπτεται στο σύστημα αποχέτευσης του νερού.
8) Ανοσοκυτταροχημική διαδικασία χρώσης – χειροκίνητη μέθοδος
Μονιμοποιημένο κυτταρολογικό παρασκεύασμα σε αντικειμενοφόρο πλάκα, PEG (εφόσον χρησιμοποιείται) αφαιρείται σε 2 αλλαγές 95% μεθανόλης. Συμπεριλαμβάνετε αντικειμενοφόρο πλάκα θετικού ελέγχου (positive control) και αρνητικού ελέγχου (negative control) για τη δοκιμασία.
N.B. Στάδια 1 και 2 μπορούν να πραγματοποιηθούν και με αντίστροφη σειρά εάν προτιμάται.
TBS μπορεί να αντικατασταθεί από PBS καθόλη τη διαδικασία εάν προτιμάται.
Αυτά τα στάδια της μεθόδου είναι τα ίδια με τη χειροκίνητη μέθοδο, εκτός του ότι τα στάδια 1 και 2 πιθανώς να γίνονται καλύτερα με αντεστραμμένη σειρά. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες τοποθετούνται σε βάσεις Sequenza μετά τα στάδια ανάκτησης αντιγόνου και αποκλεισμού ενδογενούς υπεροξειδάσης που έγιναν στις βάσεις. Τα στάδια πλύσης είναι για 5 λεπτά το καθένα και γίνονται με PBS που περιέχει 0.05% Tween 20. Αυτό είναι απορρυπαντικό που βοηθάει το ρυθμιστικό διάλυμα να κινηθεί ομαλά πάνω στην αντικειμενοφόρο πλάκα. Ο χώρος στην κορυφή μεταξύ της αντικειμενοφόρου πλάκας και της καλυπτρίδας γεμίζει με το ρυθμιστικό διάλυμα (από ένα μπουκάλι πλύσης) και χρειάζεται 3 με 5 λεπτά για τρέξει. Διασφαλίστε οπτικά ότι όλο το ρυθμιστικό διάλυμα έχει τρέξει πριν την προσθήκη διαλύματος αντισωμάτων αποφεύγοντας την αραίωση του.
Κάθε στάδιο με αντίσωμα απαιτεί 100 µl αραιωμένου αντισώματος ανά αντικειμενοφόρο πλάκα.
Η ανάπτυξη της υπεροξειδάσης και η πυρηνική χρώση (χρησιμοποιείστε Mayer’s Haemalum, που δεν χρειάζεται διαφοροποίηση) μπορούν να γίνουν πάνω σε βάσεις Sequenza, μόλις το κατάλληλο χρονικό διάστημα επώασης έχει τυποποιηθεί. Απορρίψτε τα εναπομείναντα διαλύματα στις βάσεις με τον ίδιο τρόπο όπως με το χρησιμοποιημένο διάλυμα DAB στη χειροκίνητη μέθοδο.
Μετά από αυτό το στάδιο, αφαιρέστε τον συνδυασμό αντικειμενοφόρου πλάκας/καλυπτρίδας από τη βάση, διαχωρείστε τα 2 κάτω από την επιφάνεια του νερού σε ένα τρυβλίο, τοποθετήστε σε μία βάση αντικειμενοφόρων πλακών και αφυδατώστε, καθαρίστε και καλύψτε ως συνήθως.
Εάν οι καλυπτρίδες αποχρωματιστούν με το DAB, τοποθετήστε τις σε νερό στο οποίο έχει προστεθεί χλωρίνη (Υποχλωριώδες νάτριο) overnight. Λάβετε μέριμνα να μην αφήσετε τη λεία επιφάνεια των καλυπτρίδων να γρατζουνιστεί. Ξεπλύνετε με απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό και τοποθετήστε ξεχωριστά να στεγνώσουν πριν επανατοποθετηθούν στο κουτί αποθήκευσης τους.