Εξοπλισμός

Σήμερα πολλά εργαστήρια διαθέτουν μηχανήματα αυτόματης ανοσοκυτταροχημικής χρώσης για διαγνωστική ανοσοκυτταροχημεία ρουτίνας. Έπειτα από κατάλληλη μονιμοποίηση (και απομάκρυνση του στρώματος PEG, εάν χρησιμοποιείται, σε δύο αλλαγές 95% μεθανόλης) οι αντικειμενοφόρες πλάκες τοποθετούνται σε ειδικές θέσεις στο μηχάνημα και τα παρασκευάσματα υπόκεινται σε διάφορα στάδια σε μία προγραμματισμένη αλληλουχία. Τα αντισώματα και η αραίωση τους (εάν δεν είναι έτοιμα προς χρήση) συνήθως χορηγούνται από τον προμηθευτή του μηχανήματος αυτόματης ανοσοκυτταροχημικής χρώσης.

Σε άλλα εργαστήρια αυτά τα στάδια πρέπει να εκτελούνται χειροκίνητα, τοποθετώντας τα παρασκευάσματα σε περιβάλλον με υγρασία όπως τα εμπορικά διαθέσιμα πλαστικά ή Perspex επιφάνεια χρώσης. Αυτές περιέχουν θέσεις για την τοποθέτηση των αντικειμενοφόρων πλακών, μία θέση για νερό για διατήρηση  της υγρασίας στην ατμόσφαιρα και ένα καπάκι. Είναι σημαντικό τα παρασκευάσματα να μην αποξηρανθούν κατά την διάρκεια της διαδικασίας καθώς αυτό θα αλλοιώσει τη μορφολογία. Όμως, πλήρως ικανοποιητικός εξοπλισμός μπορεί να είναι τόσο απλός όσο τα μεγάλα πλαστικά τρυβλία Petri  (14cm διαμέτρου) τα οποία μπορεί να χωρέσουν 4 αντικειμενοφόρους πλάκες. Θέσεις δημιουργούνται τοποθετώντας ξύλινους προσαρμογείς στον πάτο του τρυβλίου (εμβάπτιση σε ξυλόλη και τοποθέτηση στον πάτο του τρυβλίου), και μία μπάλα υγρού χαρτιού ή βαμβακιού τοποθετείται στο τρυβλίο μαζί με τις αντικειμενοφόρες πλάκες για τη διατήρηση της υγρασίας. Τα τρυβλία που κατασκευάζονται από Sterilin (140mm cat.no. 501V) φέρουν παρυφές που επιτρέπουν την κατακόρυφη διάταξη τους, κερδίζοντας με αυτόν τον τρόπο χώρο στον πάγκο εργασίας.

 

 

 

Το κυτταρολογικό παρασκεύασμα μπορεί να απομονωθεί κυκλώνοντας το με ένα ειδικό στυλό γεμισμένο με κηρώδη ουσία, αφήνοντας ένα σύνορο γύρω από τον ιστό. Αυτό διασφαλίζει ότι τα αντιδραστήρια που έχουν εναποθετηθεί στην περιοχή του ιστού θα παραμένουν στη θέση τους χωρίς να διαχυθούν σε όλη την αντικειμενοφόρο πλάκα, και μειώνει την ανάγκη για πολύ προσεκτικό σκούπισμα μεταξύ των διαφόρων σταδίων της μεθόδου. Το στυλό εφαρμόζει πιο εύκολα σε στεγνή περιοχή της αντικειμενοφόρου πλάκας, αλλά το παρασκεύασμα πρέπει να διατηρείται υγρό. Πολλές εταιρείες παρέχουν τέτοια στυλό  (πχ. Dako delimiting pen S2002, Vector ImmEdge hydrophobic barrier pen, H-4000). Ο κύκλος σήμανσης απομακρύνεται κατά το τελικό στάδιο καθαρισμού πριν τη μονιμοποίηση του παρασκευάσματος. Είναι επίσης επιθυμητό να χαραχθεί ένας κύκλος γύρω από την κυτταρική περιοχή στο πίσω μέρος της αντικειμενοφόρου πλάκας με έναν υαλογράφο έτσι ώστε η περιοχή του ιστού να είναι ορατή έπειτα από σκούπισμα της πίσω πλευράς της αντικειμενοφόρου πλάκας μεταξύ των στρωμάτων.  

Ένας χρήσιμος εξοπλισμός ημι-αυτοματοποιημένης ανοσοκυτταροχημικής χρώσης είναι το σύστημα Sequenza (Thermo Scientific  10098889, θέση για 10 αντικειμενοφόρες πλάκες; 11927774, καλυπτρίδες, συσκευασία των 250). Αυτό μπορεί να θεωρηθεί ακριβό στην αρχή (αν και όχι συγκριτικά με αυτοματοποιημένο μηχάνημα) αλλά είναι μία αξιόλογη επένδυση η οποία αυξάνει σημαντικά την παραγωγικότητα και μειώνει το στρες. Οι καλυπτρίδες λειτουργούν εγγυημένα για μία μόνο χρήση, αν και η εμπειρία μας έχει δείξει ότι μπορούν να επαναχρησιμοποιηθούν εκτενώς μέχρι ότου το έλασμα γίνει χαλαρό. Σε αυτό το σύστημα η αντικειμενοφόρος πλάκα τοποθετείται στην παρασκευαστική πλευρά έναντι της καλυπτρίδας, σταθεροποιείται με ειδικούς μικρούς πασσάλους, και εισάγεται σε μία ανοιχτή θέση υπό τη γωνία που υποδεικνύεται από τη θέση αυτή. Ένας θάλαμος στη κορυφή επιτρέπει στο ρυθμιστικό διάλυμα ή το αντίσωμα να προστεθεί στην αντικειμενοφόρο πλάκα. Ρυθμιστικό διάλυμα (περίπου 5 ml) ρέει κατά μήκος του παρασκευάσματος, ξεπλένοντας το αποτελεσματικά σε 5 λεπτά συγκριτικά με τα 15 λεπτά της «χειροκίνητης» μεθόδου. Διαλύματα αντισωμάτων προστίθενται σε 100µl πάνω στο παρασκεύασμα. 20 µl καταλήγουν στο πάτο του χώρου συλλογής ενώ τα 80 µl διατηρούνται πάνω στην αντικειμενοφόρο πλάκα.

Ο τριχοειδής χώρος μεταξύ της καλυπτρίδας και της αντικειμενοφόρου πλάκας επιτρέπει την ελεύθερη κίνηση των μορίων έτσι ώστε το αντίσωμα να μπορεί να προσδέσει το αντιγόνο του στο παρασκεύασμα. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες δεν απομακρύνονται από τις θέσεις για πλύση μεταξύ των σταδίων. Μέριμνα πρέπει να ληφθεί ώστε όλο το ρυθμιστικό διάλυμα να έχει απομακρυνθεί πριν την προσθήκη του επόμενου αντιδραστηρίου για να διασφαλιστεί ότι δεν αραιώνεται σε εναπομένον προηγούμενο ρυθμιστικό διάλυμα.

Το ειδικό στυλό δεν θα πρέπει να χρησιμοποιείται με το σύστημα Sequenza καθώς θα εμπόδιζε την ελεύθερη ροή διαλύματος κατά μήκος του παρασκευάσματος. Ένας κύκλος με υαλογράφο  γύρω από το παρασκεύασμα στην πίσω πλευρά της αντικειμενοφόρου πλάκας μπορεί να είναι χρήσιμος στο στάδιο της κάλυψης.

Άλλος εξοπλισμός που χρησιμοποιείται περιλαμβάνει δοχεία για το ρυθμιστικό διάλυμα, θέσεις για τα πλακίδια, φούρνο μικροκυμάτων (ένα οικιακό μοντέλο είναι ικανοποιητικό), πλαστικά δοχεία και θέσεις αντικειμενοφόρων πλακών για χρήση εντός του φούρνου.

X