Αραίωση αντισωμάτων

Διαλύτης

Ένας πρότυπος διαλύτης αντισωμάτων για πρωτογενή αντισώματα είναι ο 0.01M φυσιολογικός ορός με διάλυμα φωσφορικών ιόντων (0.87% NaCl), pH 7.2 έως 7.4 (PBS) που περιέχει 0.1% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) και 0.1% αζίδιο νατρίου ως συντηρητικά. Τρις/HCl-ρυθμιστικός ορός, pH 7.6 (TBS), μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί. Η BSA δρα ως αδρανής πρωτεΐνη που μπορεί να προσδεθεί σε όλα τα «κολλώδη» σημεία στα τοιχώματα του περιέχοντος φιαλιδίου και με αυτόν τον τρόπο διατηρεί τα αντισώματα ελεύθερα μέσα στο διάλυμα. Πολλά αντισώματα μπορούν να διατηρηθούν στη βέλτιστη τιμή αραίωσης σε αυτό το διάλυμα στους 4°C που διασφαλίζει την ομοιομορφία στις δοκιμασίες, αλλά συνιστάται να ελέγχεται η δυνατότητα για μακροχρόνια συντήρηση τους.

 

Βελτιστοποίηση αραίωσης

Πρωτογενή αντισώματα μπορεί να προμηθεύονται «έτοιμα προς χρήση» είτε σε συμπυκνωμένη μορφή. Συνιστάται πάντοτε να δοκιμάζετε μία σειρά αραιώσεων για τον προσδιορισμό της τιμής της βέλτιστης αραίωσης για το σύστημα ανίχνευσης που χρησιμοποιείτε, καθόσον είναι πιθανόν να χρησιμοποιείτε μία περισσότερο ή λιγότερο ευαίσθητη μέθοδο σε σχέση με αυτήν του προμηθευτή. Μονοκλωνικά αντισώματα συνήθως αντιδρούν καλύτερα σε ένα εύρος μεταξύ 1 έως 20 µg/ml. Πολυκλωνικά αντισώματα ποικίλουν σημαντικά, από αραίωση 1/100 έως 1/10,000 ή περισσότερο.

Η δοκιμασία διεξάγεται σε παρασκευάσματα ιστού που είναι γνωστό ότι περιέχουν το αντιγόνο ενδιαφέροντος, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο που θα χρησιμοποιηθεί για τις διαγνωστικές διαδικασίες. Για οικονομία, η μεγαλύτερη αραίωση η οποία δίνει μία έντονη ανοσοκυτταροχημική χρώση έναντι του χαμηλότατου μη-ειδικού «υποβάθρου» θα πρέπει να επιλεγεί. Αυτό θα εξασφαλίσει μία περίσσεια αντισώματος πάνω στο αντιγόνο των ιστών και τότε θα γίνει το πρότυπο για όλα τα παρασκευάσματα προς χρώση. Εάν γνωστά κυτταρολογικά παρασκευάσματα θετικού ελέγχου (positive controls) δεν είναι διαθέσιμα, οι δοκιμασίες μπορούν να πραγματοποιηθούν σε τομές παραφίνης κατάλληλου ιστού, και η επιλεγμένη βέλτιστη αραίωση θα είναι κατάλληλη για κυτταρολογικά παρασκευάσματα.

Δευτερογενή αντισώματα (εφόσον δεν προμηθεύονται «έτοιμα προς χρήση») θα πρέπει επίσης να δοκιμάζονται και συνήθως φαίνεται να αντιδρούν καλά σε εύρος από 1/100 έως 1/500. Σεσημασμένα δευτερογενή αντισώματα δεν θα πρέπει να αποθηκεύονται αραιωμένα καθώς υπάρχει ένας (μικρός) κίνδυνος να αποκολληθεί η σήμανση τους. Υπεροξειδάση-σεσημασμένα αντισώματα δεν θα πρέπει να αραιώνονται ή να αποθηκεύονται σε  σε διαλύματα που περιέχουν αζίδιο νατρίου, καθόσον αυτό αναστέλλει την ενζυμική αντίδραση. Χρησιμοποιείτε μόνον PBS για αραίωση του αντισώματος.

 

Διάρκεια της αντίδρασης

Το πρωτογενές αντίσωμα αφήνεται συνήθως να αντιδράσει με τα παρασκευάσματα για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και το δευτερογενές αντίσωμα για 30 λεπτά. Όμως, με όλα τα στάδια αποκλεισμού και τις περιόδους πλύσης, η διαδικασία από την αρχή έως το τέλος της μπορεί να διαρκέσει αρκετές ώρες. Εάν η διαδικασία διεξάγεται «χειροκίνητα», θα ήταν βολικό η επώαση με το πρωτογενές αντίσωμα να γίνει overnight (στους 4°C σε σκοτεινό θάλαμο) και να ολοκληρωθεί η αντίδραση την επόμενη ημέρα. Η επιλεγμένη για το μονοκλωνικό αντίσωμα αραίωση δεν θα πρέπει να χρειάζεται προσαρμογή κάτω από αυτές τις συνθήκες διότι υπάρχει μόνο ένα είδος αντισώματος στο διάλυμα. Ένα πολυκλωνικό αντίσωμα πιθανόν να δίνει καλύτερα αποτελέσματα σε μεγαλύτερη αραίωση εάν χρησιμοποιείται η μεγαλύτερη χρονικά περίοδος επώασης, επειδή το διάλυμα θα περιέχει ένα μίγμα αντισωμάτων σε διαφορετικές περιοχές του ίδιου αντιγονικού μορίου, κάποια από τα οποία ενδέχεται να είναι πιο «αργά» ως προς την πρόσδεση και να μην προσκολλώνται κατά την διάρκεια της πιο σύντομης περιόδου επώασης. Επιπρόσθετα, σε ένα πολυκλωνικό αντι-ορό, όλες οι ανεπιθύμητες ανοσοσφαιρίνες που πιθανόν προσδένονται μη ειδικά στον ιστό θα αραιωθούν και τελικά θα είναι ελάσσονος σημασίας. Η σειρά των αραιώσεων θα πρέπει να επανεκτελεστεί εάν η περίοδος επώασης αλλάξει. Μετά την προσθήκη του πρωτογενούς αντισώματος, τα παρασκευάσματα θα πρέπει να επωαστούν σε αυτό παρά σε ρυθμιστικό διάλυμα το οποίο πιθανόν να προκαλέσει  αποκόλληση των χαλαρά προσδεδεμένων αντισωμάτων.

X