Αρχές της ανοσοκυτταροχημείας

Υπάρχουν πάρα πολλές μέθοδοι για τη διεξαγωγή ανοσοκυτταροχημείας- εκτενείς αναφορές είναι διαθέσιμες στο διαδίκτυο (πχ με αναζήτηση όρων όπως Ανοσοκυτταροχημικές Μέθοδοι). Μία καλά διαμορφωμένη και χρήσιμη μέθοδος θα περιγραφεί εδώ – η έμμεση (2 στρωμάτων) μέθοδος με χρήση πολυμερικής υπεροξειδάσης σεσημασμένα δευτερογενή αντισώματα.

Το αντιγόνο ενδιαφέροντος διατηρείται στα κύτταρα με μονιμοποίηση σε αλκοόλη και/ή φορμόλη. Το πρωτογενές αντίσωμα, συνήθως αναπτυσσόμενο σε λαγό ή ποντίκι, προσδένεται στο αντιγόνο και η περίσσεια αντισώματος απομακρύνεται με έκπλυση με ρυθμιστικό διάλυμα. Το δευτερογενές αντίσωμα  αναπτύσσεται   (σε κατσίκα ή άλλα είδη ζώου) στις ανοσοσφαιρίνες του πρωτογενούς αντισώματος του ξενιστή  (πχ αντι-ποντικιού Ig κατσίκας) και προσδένεται στο πρωτογενές αντίσωμα στο σημείο που έχει προσδεθεί το αντιγόνο. Το δευτερογενές αντίσωμα σημαίνεται έτσι ώστε η αντίδραση να είναι ορατή στο μικροσκόπιο. Η πιο αποτελεσματική σήμανση είναι η πολυμερική υπεροξειδάση χρένου (horseradish ) που παρέχει μία μεγάλη ποσότητα ενζυμικής σήμανσης στο μόριο του δευτερογενούς αντισώματος. Έπειτα από περαιτέρω πλύσεις, η υπεροξειδάση αλληλεπιδρά με το υπόστρωμα της, το υπεροξείδιο του υδρογόνου, και ένα χρωμογόνο, συνήθως διαμινοβενζιδίνη (DAB) που δίνει ένα σκούρο καφέ, αδιάλυτο ίζημα στο σημείο της αντίδρασης. Το παρασκεύασμα τότε μπορεί να  χρωματιστεί με αιματοξυλίνη, να αφυδατωθεί σε διαβαθισμένη αλκοόλη, να καθαριστεί σε διαλύτη όπως η ξυλόλη και να καλυφθεί μόνιμα. 

 

 
 

 

Ανάκτηση αντιγόνων

Ανοσο-αντιδράσεις ενισχύονται συχνά από θερμο-επαγόμενη ανάκτηση αντιγόνων (HIER). Αυτή η διαδικασία δεν είναι απαραίτητη πάντοτε για κυτταρολογικά παρασκευάσματα που έχουν μονιμοποιηθεί σε αλκοόλη, αλλά συνήθως προσφέρει το πλεονέκτημα αποκάλυψης της μέγιστης ανοσοαντίδρασης των μονιμοποιημένων αντιγόνων, ειδικότερα έπειτα από τη μονιμοποίηση σε φορμόλη. HIER διεκπεραιώνεται είτε πριν είτε μετά από το στάδιο αποκλεισμού υπεροξειδάσης. Τα παρασκευάσματα εμβαπτίζονται σε ρυθμιστικό διάλυμα και θερμαίνονται μέσα σε κλειστό πλαστικό δοχείο σε ένα φούρνο μικροκυμάτων (οικιακός φούρνος σε πλήρη ισχύ) ή σε ατμομάγειρα ή σε αυτόκλειστο, για ένα προκαθορισμένο χρονικό διάστημα. Η περίοδος θέρμανσης (συνήθως 10 με 20 λεπτά) θα εξαρτηθεί από το εάν τα παρασκευάσματα θα τοποθετηθούν σε κρύο ρυθμιστικό διάλυμα και μετά θα θερμανθούν ή εάν θα τοποθετούν απευθείας σε θερμό ρυθμιστικό διάλυμα, και εάν αφήνονται να κρυώσουν στο ρυθμιστικό διάλυμα ή εάν ψύχονται απευθείας με τρεχούμενο κρύο νερό στο δοχείο. Είναι σημαντικό να μην απομακρύνονται από το ζεστό ρυθμιστικό διάλυμα το οποίο επειδή θα εξατμιστεί αμέσως, θα αποξηράνει τα παρασκευάσματα. Κατά την περίοδο θέρμανσης στο φούρνο μικροκυμάτων μπορεί να χρειαστεί να αναπληρωθεί το επίπεδο της στάθμης του υγρού κατά διαστήματα με ζεστό απεσταγμένο νερό  προς αντικατάσταση του υγρού που έχει εξατμισθεί  και να διατηρούνται οι αντικειμενοφόρες πλάκες εμβαπτισμένες.  Όταν μία βολική μέθοδος ανάκτησης έχει καθιερωθεί, αυτή θα πρέπει να γίνει το standard του εργαστηρίου. Το ρυθυμιστικό διάλυμα χρήσης θα πρέπει να δοκιμάζεται για κάθε νέο αντίσωμα (ή να χρησιμοποιείται εκείνο που προτείνεται από τον προμηθευτή). Ορισμένα αντιγόνα φανερώνονται καλύτερα έπειτα από θέρμανση σε ελαφρώς όξινο ρυθμιστικό διάλυμα (0.01M κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα, pH 6.0), άλλα σε αλκαλικό ρυθμιστικό διάλυμα (TRIS/EDTA, pH9.0). Αυτά μπορούν εύκολα να προετοιμαστούν στο εργαστήριο.  Οι περισσότερες εταιρείες αντισωμάτων παρέχουν τα κατάλληλα ρυθμιστικά διαλύματα. (Για ανασκόπηση, δες Shi et al, 2011).

Βήματα αποκλεισμού

Ενδογενής υπεροξειδάση

Ορισμένα κύτταρα περιέχουν ένζυμα που ομοιάζουν την υπεροξειδάση τα οποία πρέπει να αποκλειστούν για να αποτραπεί η αντίδραση τους στο τελικό απεικονιστικό στάδιο με την σεσημασμένη υπεροξειδάση, που μπορεί να προκαλέσει σύγχυση στη τελική εικόνα. Ο αποκλεισμός γίνεται πριν την προσθήκη των αντισωμάτων, χρησιμοποιώντας περίσσεια υποστρώματος, υπεροξείδιο του υδρογόνου, σε μία πολύ υψηλότερη συγκέντρωση από εκείνη που χρησιμοποιείται για την αποκάλυψη του συνδεδεμένου στο αντίσωμα ενζύμου στο τέλος. Αυτό αποτελεσματικά εμποδίζει περαιτέρω δράση του ενδογενούς ενζύμου.

Caption here

 

Χρώση μη-ειδικού υποβάθρου

Μερικές φορές  Fc υποδοχείς στα κύτταρα μπορεί να προσθέσουν τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται, ή πρωτεΐνες στα παρασκευάσματα μπορεί να αντιδράσουν μη-ειδικά με αυτά μέσω φορτισμένων ή υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων. Τέτοια μη-ειδικά προσδεμένα πρωτογενή ή δευτερογενή αντισώματα θα  αλληλεπιδράσουν στη συνέχεια με τον ίδιο τρόπο όπως τα ειδικά αντισώματα και θα δώσουν ένα παραπλανητικό αποτέλεσμα. Αυτές οι αντιδράσεις θα είναι ορατές σε παρασκευάσματα αρνητικού ελέγχου (negative controls) όπου το πρωτογενές αντίσωμα παραλείπεται ή αντικαθίσταται από ένα μη σχετικό αντίσωμα. Μη-ειδικές αντιδράσεις αυτής της φύσης μπορούν να αποκλειστούν με ένα στρώμα μη-άνοσου ορού (από το ίδιο είδος με το δευτερογενές αντίσωμα) πριν την προσθήκη του πρωτογενούς αντισώματος. Όταν οι μη-ειδικές θέσεις καλύπτονται από φυσιολογική ανοσοσφαιρίνη, το πρωτογενές αντίσωμα δεν μπορεί να προσδεθεί σε αυτές και με την προϋπόθεση ότι το αντίσωμα αποκλεισμού είναι από το ίδιο είδος με το δευτερογενές αντίσωμα, επίσης δεν μπορεί να προσδεθεί.

 

Caption here
Caption here
Caption here

 

X