Παρασκευή και μονιμοποίηση των δειγμάτων

Αν το δείγμα περιέχει αρκετό υλικό, μετά από την παρασκευή απλών επιχρισμάτων ή/και κυτταροφυγοκέντρηση για άμεση αξιολόγηση, η μέθοδος επιλογής είναι η φυγοκέντρηση του υπολοίπου υλικού σε ένα κυτταρικό ίζημα που έχει μονιμοποιηθεί σε 10% φορμόλη (φυσιολογικός ορός ή  φορμόλη με διάλυμα φωσφορικών ιόντων) με επακόλουθη αφυδάτωση σε διαβαθμισμένη αλκοόλη και εγκλεισμός σε παραφίνη για δημιουργία τομών. Αυτό έχει το πλεονέκτημα ότι επιτρέπει πολλές τομές για πολλαπλές ανοσοκυτταροχημικές δοκιμασίες. Τομές από αυτά τα blocks πρέπει να υποβληθούν σε ανάκτηση αντιγόνων με θέρμανση σε ρυθμιστικό διάλυμα και πρέπει να  τοποθετούνται σε φορτισμένες αντικειμενοφόρες πλάκες για αποφυγή αποκόλλησης κατά την διαδικασία της θέρμανσης.

Τα περισσότερα δείγματα που παραλαμβάνονται στο κυτταρολογικό εργαστήριο δεν περιέχουν αρκετό υλικό για την προαναφερθείσα διαδικασία και προετοιμάζονται με κυτταροφυγοκεντρήσεις ή χρησιμοποιώντας κυτταρολογία υγρής φάσης (LBC). Παρασκευάσματα κυτταροφυγοκέντρησης που προκύπτουν από εναιωρήματα κυττάρων στο αρχικό τους υλικό έχουν ως αποτέλεσμα πεπλατυσμένα κύτταρα σε μία μικρή περιοχή της αντικειμενοφόρου πλάκας η οποία μπορεί τότε να αποξηρανθεί για μετα-μονιμοποίηση ή για άμεση «υγρή-μονιμοποίηση» σε αλκοόλη. Η ίδια διαδικασία μπορεί να εφαρμοστεί στα επιχρίσματα. Η κυτταρολογία υγρής φάσης περιλαμβάνει προ-μονιμοποίηση του δείγματος σε αλκοολούχο μονιμοποιητικό πριν τη δημιουργία παρασκευάσματος σε μηχάνημα το οποίο φιλτράρει το υγρό από τα κύτταρα, έπειτα προωθεί το κυτταρικό ίζημα σε μία λεπτή στιβάδα πάνω στην προκαθορισμένη επιφάνεια της αντικειμενοφόρου πλάκας. Τα παρασκευάσματα είναι άριστα αλλά ο όγκος των μονιμοποιημένων κυττάρων που απαιτείται για τη δημιουργία μίας αντικειμενοφόρου πλάκας σημαίνει ότι λίγες μπορεί να παρασκευαστούν από ένα δείγμα, και ο εξοπλισμός και οι αντικειμενοφόρες πλάκες είναι ακριβά, αν και το μονιμοποιητικό δεν είναι.

 

Μακρόχρονη διατήρηση των δειγμάτων

Λόγω οικονομικών περιορισμών, η διατήρηση των προϊόντων κυτταροφυγοκέντρησης και των  “Thinprep™” της προαναφερθείσας LBC μεθόδου  μπορεί να αποτελέσει μη εφικτό στόχο για εργαστήρια σε αναπτυσσόμενες χώρες, καθώς επίσης και οι ανοσοκυτταροχημικές δοκιμασίες που επιβεβαιώνουν και επεκτείνουν την αρχική διάγνωση που έγινε σε επιχρίσματα με βάση τα κλινικά δεδομένα σε συνδυασμό με χρώση Giemsa- ή κατά Παπανικολάου. Πολλά τμήματα για αυτό το λόγο στέλνουν δείγματα στο εξωτερικό για περαιτέρω διάγνωση και είναι ατυχές ότι το λιγοστό υλικό συχνά φτάνει μη κατάλληλα διατηρημένο για τις απαιτούμενες δοκιμασίες. Τα αποξηραμένα επιχρίσματα, για παράδειγμα, ακόμη και αν έχουν μονιμοποιηθεί σε αλκοόλη πριν το στέγνωμα, είναι πιθανόν να υποστούν αλλοίωση αντιγόνων, εκτός και αν έχουν καταψυχθεί και έχουν μεταφερθεί με ξηρό πάγο. Υδατομονιμοποιημένα ή αποξηραμένα, μονιμοποιημένα σε φορμόλη επιχρίσματα μπορεί να ενυδατωθούν με έως και 5 λεπτά εμβάπτιση σε φυσιολογικό ορό πριν από περαιτέρω μονιμοποίηση ή ανοσοκυτταροχημική χρώση (Leong et al, 1999) αλλά σε όλες αυτές τις περιπτώσεις τα αποτελέσματα μπορεί να μην είναι αξιόπιστα.

Η μία υποστηρίζεται από τον φορέα UKNEQAS for Immunocytochemistry και εφαρμόζεται σε επιχρίσματα, εντυπώματα ή παρασκευάσματα κυτταροφυγοκέντρησης. Είτε πριν είτε μετά από τη μονιμοποίηση σε αλκοόλη και χωρίς να επιτραπεί η αποξήρανση του παρασκευάσματος, το παρασκεύασμα καλύπτεται με διάλυμα 10% πολυαιθυλικής γλυκόλης 1450 (PEG) σε 50% μεθανόλη, έπειτα αφήνεται να στεγνώση πριν την αποθήκευση του (σε θερμοκρασία δωματίου) ή τη μεταφορά του. Η PEG δημιουργεί μία λεπτή στιβάδα πάνω από το παρασκεύασμα που προστατεύει τα αντιγόνα και δεν επηρεάζει τη μορφολογία (Maxwell et al, 1999; Kirbis et al, 2011). Αφαιρείται πριν την ανοσοκυτταροχημική διαδικασία σε δυο αλλαγές 95% μεθανόλης ενώ η περαιτέρω μονιμοποίηση διεξάγεται όπως απαιτείται. Μία εμπορική παραλλαγή  διαλύματος PEG , το Cytofixx, δεν είναι πλέον διαθέσιμο.

Η δεύτερη μέθοδος έχει το πλεονέκτημα ότι παρέχει περισσότερο υλικό αλλά και το μειονέκτημα ότι απαιτεί μεταφορά σε αλκοολούχο διάλυμα το οποίο μπορεί να δημιουργήσει προβλήματα με τις μεταφορικές εταιρείες (αλλά δες παρακάτω για αποθήκευση και μεταφορά με χρήση διαλύματος PEG) . Δείγματα αναρρόφησης δια λεπτής βελόνης ή άλλα κυτταρολογικά παρασκευάσματα τοποθετούνται απευθείας στο αλκοολούχο μονιμοποιητικό που χρησιμοποιείται για LBC όπως το PreservCyt™ (70% μεθανόλη σε ειδικό ρυθμιστικό διάλυμα) και μπορούν να μεταφερθούν μέσα σε αυτό το διάλυμα ή να αποθηκευτούν σε θερμοκρασία περιβάλλοντος επ’ αόριστον. Ανοσοκυτταροχημικές χρώσεις πραγματοποιήθηκαν σε κυτταρολογικά δείγματα από μία Αφρικανική χώρα μετά από 6 χρόνια παραμονής τους σε PreservCyt σε θερμοκρασία δωματίου και προέκυψαν τα ίδια αποτελέσματα με εκείνα τα δείγματα που παραλήφθηκαν την πρώτη φορά. Εάν το δείγμα είναι αιμορραγικό ή βλεννώδες, μπορεί να καθαριστεί πρώτα με πλύση  σε διάλυμα 50% ρυθμιστικής αλκοόλης (πχ Cytolyt ™)  ή  Esposti’s διάλυμα  (δες Παράρτημα) για σύντομη περίοδο ώστε να γίνει η απομάκρυνση των πρωτεϊνών και η λύση των ερυθροκυττάρων. Μετά τη φυγοκέντρηση, το υπερκείμενο απορρίπτεται και αντικαθίσταται από το μονιμοποιητικό. Ακόμη και χωρίς ενδιάμεση πλύση, η οποία είναι δύσκολη εκτός και εάν υπάρχει διαθέσιμο προσωπικό και φυγόκεντροι, όταν υπάρχει υπόνοια λεμφώματος και άλλα FNA δείγματα τοποθετούνται απευθείας σε 2 ml PreservCyt διατηρώντας άριστη μορφολογία και ανασοκυτταροχημικές αντιδράσεις. Για μακρόχρονη αποθήκευση, το επίπεδο της στάθμης του μονιμοποιητικού στα φιαλίδια θα πρέπει να ελέγχεται περιοδικά για τυχόν εξάτμιση και να αναπληρώνεται όταν απαιτείται. Επιπλέον της ανοσοκυτταροχημείας, τα δείγματα είναι κατάλληλα για DNA απομόνωση για γενετικές μελέτες και υβριδισμό in situ (πχ EBER για EBV και c-myc αντιμετάθεση) (Van Noorden et al 2011).

Για να διατηρηθεί το υλικό για μελλοντική εργασία, χρησιμοποιούμε όσο το δυνατόν λιγότερο PreservCyt-μονιμοποιημένο δείγμα. Αν και τα προϊόντα κυτταροφυγοκέντρησης θα παρέχουν πιο πεπλατυσμένα κύτταρα, καταναλώνουν πολύ από το δείγμα, ωστόσο επετεύχθη με μόνο 1.5 µl κυτταρικού εναιωρήματος εναποτιθέμενο πάνω σε μία φορτισμένη αντικειμενοφόρο πλάκα και  αποξηραίνοντας το για 1 ώρα.  Μετά το στέγνωμα, η περιοχή του δείγματος σημαίνεται με ειδικό υαλογράφο στην πίσω πλευρά της αντικειμενοφόρου πλάκας, διαφορετικά θα είναι δύσκολο να εντοπιστεί η περιοχή της αντικειμενοφόρου πλάκας που είναι υγρή. Τα παρασκευάσματα έπειτα μετα-μονιμοποιούνται σε 10% φυσιολογικό ορό για 10 λεπτά, ξεπλένονται με ορό και εξετάζονται με μορφολογικές χρώσεις και τις απαιτούμενες ανοσοκυτταροχημικές μεθόδους. Αυτές μπορεί να περιλαμβάνουν την ανάκτηση αντιγόνων με θέρμανση των αντικειμενοφόρων πλακών σε ρυθμιστικό διάλυμα στο φούρνο μικροκυμάτων για 20 λεπτά. Έως σήμερα, δεν έχει βρεθεί αντιγόνο που να μην υφίσταται ανοσοκυτταροχημική χρώση σε υλικό που περιλαμβάνει λεμφώματα, όγκους νευρικού συστήματος, καρκινώματα κτλ, και έχει βρεθεί ότι τα συνήθη διαλύματα αντισωμάτων μπορούν να χρησιμοποιηθούν. Το μειονέκτημα είναι ότι κάποιος παρατηρεί ολόκληρα κύτταρα κάτω από το μικροσκόπιο και εξαιτίας των ενίοτε αλληλοκαλυπτόμενων κυττάρων είναι μερικές φορές δύσκολη η διάκριση πυρηνικών από κυτταροπλασματικές ανοσο-αντιδράσεις. Όμως, οι κυανόχροοι με αιματοξυλίνη πυρήνες είναι γενικά εύκολα διακριτοί από την καφέ  (DAB) ανοσο-αντίδραση υπεροξειδάσης. Ένα άλλο πρόβλημα είναι  η κυτταρική μήτρα που μερικές φορές περιβάλλει τα κύτταρα και χρωματίζεται από λίγα αντισώματα, πιθανώς επειδή περιέχει αντιγόνα, και τα κύτταρα μπορούν εύκολα να διακριθούν από αυτό το υπόβαθρο. Φυσικά, η επιτυχία της μεθόδου εξαρτάται πάντοτε από την ποιότητα του αρχικού δείγματος.

Ετοιμάζουμε τα παρασκευάσματα προκαταβολικά από το PreservCyt-υλικό μονιμοποίησης και πριν ή μετά το μονιμοποιητικό στάδιο με φορμόλη, καλύπτουμε με διάλυμα PEG όπως αναφέρθηκε παραπάνω. Οι αποξηραμένες αντικειμενοφόρες πλάκες τότε μπορούν να διατηρηθούν για εβδομάδες ή μήνες και είναι κατάλληλες για να αποσταλούν σε άλλο κέντρο εάν η μεταφορά δειγμάτων σε αλκοολούχο μονιμοποιητικό είναι δύσκολη. Η μέθοδος δεν είναι ακριβή (το μονιμοποιητικό και η PEG είναι φτηνά) και δεν απαιτεί εξοπλισμό με εξαίρεση μία μικροπιπέττα και ρύγχη και μπορεί επομένως να χρησιμοποιηθεί σε ασθενέστερες οικονομικά χώρες. Προτείνονται φορτισμένες αντικειμενοφόρες πλάκες.

Τα αλκοολούχα μονιμοποιητικά κάνουν διαπερατή την κυτταρική μεμβράνη έτσι ώστε τα διαλύματα αντισωμάτων να μπορούν να εισέλθουν στα κύτταρα. Εάν το υλικό είναι κυρίως μονιμοποιημένο στη φορμόλη, μπορεί να είναι απαραίτητο να προστεθεί ένα βήμα διαπερατοποίησης με απορρυπαντικό (πχ. Triton X-100, 0.2% ή Tween 20, 0.05-0.2%) πριν το ανοσοκυτταροχημικό πρωτόκολλο χρώσης.

X