This content is also available in:
English
Existuje mnoho metod provád?ní imunocytochemie – vy?erpávající postupy jsou zve?ejn?ny na internetu (nap?. pod heslem Imunocytochemické metody). jedna dob?e zavedená a užite?ná metoda bude popsána zde – nep?ímá (dvouvrstevná) metoda s použitím polymeru- peroxidázou zna?ené sekundární protilátky.
Hledaný antigen je v bu?kách zachován fixací alkoholem a/nebo formalinem. Primární protilátka – obvykle získaná na myších nebo králících – se váže na antigen a zbytek je odmyt pufrem. Sekundární protilátka je získána (na kozách nebo jiném živo?išném druhu) proti imunoglobulinu tv?rce primární protilátky (nap?. kozí proti myší Ig) a váže se na primární protilátku na míst?, kde je tato navázána na antigen. Sekundární protilátka je zna?ena, takže místo reakce lze vid?t v mikroskopu. Nejú?inn?jším zna?ením je polymerizovaná k?enová peroxidáza, která poskytuje silné enzymatické zna?ení na molekule sekundární protilátky. Po dalším odmytí peroxidáza reaguje se substrátem – peroxidem vodíku a chromogenem, obvykle diaminobenzidinem (DAB) který poskytuje v míst? reakce temn? hn?dé nerozpustné zbarvení. Preparáty lze následn? dobarvit hematoxylinem, odvodnit vzestupnými alkoholy, projasnit v xylénu a zamontovat.
Odhalení antigenu
Imunoreakce jsou ?asto zesilovány pomocí tepelného odhalení antigenu. To nemusí být nutné u preparát? fixovaných v alkoholu, ale obvykle je to velmi p?ínosné p?i formalinové fixaci. Tepelné odhalení se provádí bu? p?ed, nebo po blokád? endogenní peroxidázy. Preparáty jsou pono?eny do pufru a zah?ívány v uzav?eném plastovém kontejneru v mikrovlnné troub? (kuchy?ské troub? na plný výkon) nebo v tlakovém hrnci ?i autoklávu po ur?itou dobu. Doba oh?evu (obvykle 10 až 20 minut) závisí na tom, zda preparáty jsou vloženy do studeného nebo horkého pufru a zda se následn? nechají vychladnout, nebo jsou ochlazeny prudce napušt?ním studené vody do kontejneru. Je d?ležité, aby nebyly vyjmuty z horkého pufru, který by se okamžit? odpa?il a zp?sobil jejich zaschnutí. V pr?b?hu zah?ívání m?že být nutné dopl?ovat odpa?enou tekutinu horkou destilovanou vodou, aby skla z?stala pono?ena. Když je metoda demaskace antigenu v laborato?i zavedena, m?la by z?stat standardní. Pro každou nov? zavád?nou protilátku by m?l být testován pufr (p?ípadn? použit pufr doporu?ený výrobcem). N?které antigeny se nejlépe odhalí po zah?ívání v mírn? kyselém pufru (0.01M citrátový pufr, pH 6.0), jiné v alkalickém pufru (TRIS/EDTA, pH9.0). Ty lze snadno p?ipravit v laborato?i. V?tšina výrobc? protilátek dodává vhodné pufry. (P?ehled viz Shi et al, 2011)
Bloka?ní kroky
Endogenní peroxidáza
N?které bu?ky obsahují peroxidáze podobné enzymy, které musí být blokovány, aby nereagovaly v záv?re?ném peroxidázovém vizualiza?ním kroku, což by mohlo vést k falešné pozitivit?. Blokáda se provádí p?ed aplikací protilátek nadbytkem enzymového substrátu – peroxidu vodíku v mnohem v?tší koncentraci, než je používána p?i detekci vazby protilátek. To ú?inn? zabrání aktivit? endogenního enzymu.
Nespecifické zabarvení pozadí
S aplikovanými protilátkami mohou reagovat Fc receptory nebo proteiny v preparátech polárními nebo nepolárními vazbami. Takové nespecifické vazby primární nebo sekundární protilátky budou následn? reagovat jako specifické a povedou k nesprávnému (falešn? pozitivnímu) výsledku. Tyto reakce jsou odhalitelné v negativních kontrolních preparátech, v nichž je primární protilátka vynechána, nebo nahrazena irelevantní protilátkou. Nespecifické reakce této povahy mohou být blokovány vrstvou neimunního séra (téhož druhu jako sekundární protilátka) , než je aplikována primární protilátka. když jsou vazebná místa obsazena normálním imunoglobulinem, primární protilátka se na n? nem?že navázat a pokud je blokující protilátka téhož druhu jako sekundární protilátka, ani tato se nem?že navázat.
