Smíchejte:
100 ml destilované vody
45 ml metanolu
10 ml ledové kyseliny octové
Skladujte p?i b?žné teplot?
Tento pufr lze p?ipravit z komer?n? dostupných tablet (zajiš?uje správnou molaritu a pH) nebo levn?ji p?ipraven v laborato?i.
Reagencie
Chlorid sodný 8.7g
Hydrofosfore?nan draselný 0.272g
hydrofosfore?nan sodný 1.136g
nebo
Hydrofosfore?nan sodný.2H2O, 1.41g
nebo
Hydrofosfore?nan sodný.12 H2O, 2.83g
Metoda
Rozpus?te soli odd?len? v destilované vod? nebo deionizované vod? (fosfát sodný se lépe rozpouští v horké vod?) pak smíchejte, dopl?te na 1 litr a zkontrolujte pH.
Je možno p?ipravit 10x koncentrovan?jší zásobní roztok (0.1M) a ?edit pro použití. Po ?ed?ní je však nutno kontrolovat pH, protože se v koncentrátu liší.
Skladujte p?i b?žné teplot?.
Reagencie
Tris(hydroxymethyl)methylamine 6.07g
Chlorid sodný 8.7g
Koncentrovaná kyselina chlorovodíková
Metoda
Rozpus?te soli v 900 ml destilované nebo deionizované vody. P?idejte koncentrovanou HCl k dosažení pH 7.6. Dopl?te na 1 L vodou.
PBS (viz výše) s obsahem 0.1% bovinního sérumalbuminu a 0.1% azidu sodného.
Mnohé protilátky mohou být skladovány ?ed?né p?i 4°C po dlouhou dobu, avšak imunoreaktivita by m?la být periodicky testována. Normální sérum pro blokování lze obdobn? skladovat.
Nepoužívejte roztok pro peroxidázou zna?ené protilátky, protože azid sodný enzym inhibuje. K ?ed?ní použijte pouze PBS a z?ed?nou protilátku neskladujte.
V?tšina nezna?ených protilátek m?že být skladována zmrazená na -20°C, rozd?lte však zásobu na vhodné alikvoty, aby se zamezilo opakovanému rozmrazení a zamrazení. Preferováno je jediné rychlé zmrazení a rozmrazení. Pokud je to možné, zmrazte alikvoty p?ed vložením do mrazáku v tekutém dusíku. Nezamrazujte protilátky ?ed?né více než 1/100.
N?které protilátky jsou dodávány ?ed?né 1:1 v glycerolu. To zabra?uje solidifikaci protilátky v mrazáku a zásobu lze bez škody vyjímat a znovu ukládat. Výchozí ?ed?ní je nutno vzít v úvahu p?i p?íprav? pracovního roztoku.
Doporu?uje se peroxid vodíku v metanolu/PBS
Reagencie
30% peroxid vodíku 1 ml
70% metanol v PBS 100 ml
(0.3% peroxid vodíku)
Metoda
P?ipravte roztok H2O2 bezprost?edn? p?ed použitím. Pono?te preparáty na 30 minut, pak opláchn?te v PBS.
Pro 2 L:
Reagencie
Kyselina citrónová 3.8g
2 M hydroxid sodný (8% aq)
Metoda
Rozpus?te kyselinu citrónovou v 1.9 l vody
P?imíchejte roztok hydroxidu sodného (za míchání) až pH dosáhne 6.0.(Je t?eba 20-30 ml). Dopl?te na 2 l vodou.
Pufr lze uchovávat p?i pokojové teplot? n?kolik dní nebo v lednici p?i 4°C.
Reagencie
Pro 1 L (10x koncentrovaný)
Tris(hydroxymethyl)methylamin 12 g
Ethylen-diamin tetra-octová kyselina, dehydrovaná sodná s?l 1 g
1 M kyselina chlorovodíková, p?ibližn? 500 ml
Voda 500 ml
Metoda
Rozpus?te soli ve vod?.
P?imíchejte kyselinu chlorovodíkovou, míchejte a kontrolujte pH na pH 9.0
Tento roztok pufru je 10krát koncentrovaný. Skladujte p?i 4°C a ?e?te pro použití.
Použitím mikrovlnné trouby pro domácnost s oto?nou plochou
Reagencie
3,3’-Diaminobenzidin tetrahydrochlorid – DAB- (nap?. Sigma-Aldrich D5637) 50 mg
PBS 100 ml
Peroxid vodíku (30%), 30 µl (finální koncentrace 0.03%)
DAB lze koupit jako tablety nebo roztok, které se p?idávají do pufru. Pokud si chcete p?ipravit vlastní, kupte balení 5g nebo 25 g; abyste nemuseli odvažovat prášek, rozpus?te celé množství v destilované vod? na roztok o obsahu 50 mg DAB/ml. Promíchejte (zakryté) po dobu 15 minut v digesto?i, poté rozd?lte na alikvoty pro použití. Nap?íklad 5 ml alikvoty na 500 ml nebo 1 ml alikvoty na 100 ml výsledného 0.05% inkuba?ního roztoku. Zaví?kujte nádobky a umíst?te do mrazáku -20°C. P?ed použitím rozmrazte a p?idejte do odpovídajícího množství PBS. P?idejte peroxid vodíku na výslednou 0.03% koncentraci, dob?e zamíchejte a inkubujte preparáty po 10 minut.
Opláchn?te v PBS, pak ve vod? a pokra?ujte jaderným barvením.
DAB je t?eba likvidovat podle lokálních bezpe?nostních pravidel. Jde o potenciální kancerogen a nesmí být vylit do odpadu.
Fixovaný cytologický preparát: pokud byl použit PEG, odstraníme ve dvou lázních 95% metanolu). Zahr?te pozitivní a negativní kontrolní preparáty.
N.B. Po?adí krok? 1 a 2 m?že být zm?n?no, pokud to skýtá výhodu.
TBS m?že být nahrazen PBS, je-li preferován.
Kroky metody jsou stejné jako p?i manuálním postupu, pouze kroky 1) a 2) je lepší obrátit. Preparáty jsou umíst?ny do nosi?? Sequenza po demaskaci antigenu a blokáda endogenní peroxidázy se provádí v nosi?i. Oplachovací kroky trvají 5 minut každý a provád?jí se s PBS obsahujícím 0.05% Tween 20. To je detergent, který pomáhá pufru hladce stékat po skle. Prostor mezi sklem a víkem je napln?n pufrem (z omývací láhve) a protéká 3 až 5 minut. Ov??te vizuáln?, že veškerý pufr odtekl p?ed aplikací protilátky, aby nedošlo k jejímu z?ed?ní.
Každý protilátkový krok vyžaduje 100 µl ?ed?né protilátky na preparát.
Vyvolání peroxidázy a jaderné barvení (s použitím Mayerova Haemalaunu, který nevyžaduje diferenciaci) m?že být provedeno v nosi?ích Sequenza, pokud byly standardizovány ?asy. Likvidace roztok? z nosi?? probíhá u použitého roztoku DAB stejn? jako u manuální metody.
Po tomto kroku odkryjte víko /krycí desku nosi?e, odd?lte je od sebe pod vodou v d?ezu, p?eneste skla do stojánk? pro odvodn?ní, projasn?ní a montování jako obvykle.
Pokud se víko obarví DABem, umíst?te ho p?es noc do vody s b?lícím ?inidlem (chlornan sodný). Dbejte, aby se hladká ví?ka nepoškrábala. Opláchn?te je v destilované nebo deionizované vody a nechte jednotliv? oschnout p?ed uložením.