1) Espostiho tekutina

Smíchejte:

100 ml destilované vody
45 ml metanolu
10 ml ledové kyseliny octové
Skladujte p?i b?žné teplot?

2) Pufry

0.01M fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS), pH 7.2 -7.4.

Tento pufr lze p?ipravit z komer?n? dostupných tablet (zajiš?uje správnou molaritu a pH) nebo levn?ji p?ipraven v laborato?i.

Reagencie

Chlorid sodný 8.7g
Hydrofosfore?nan draselný 0.272g
hydrofosfore?nan sodný 1.136g
nebo
Hydrofosfore?nan sodný.2H2O, 1.41g
nebo
Hydrofosfore?nan sodný.12 H2O, 2.83g

Metoda

Rozpus?te soli odd?len? v destilované vod? nebo deionizované vod? (fosfát sodný se lépe rozpouští v horké vod?) pak smíchejte, dopl?te na 1 litr a zkontrolujte pH.
Je možno p?ipravit 10x koncentrovan?jší zásobní roztok (0.1M) a ?edit pro použití. Po ?ed?ní je však nutno kontrolovat pH, protože se v koncentrátu liší.
Skladujte p?i b?žné teplot?. 

0.05M Fyziologický roztok pufrovaný Tris-pufrem (TBS)

Reagencie

Tris(hydroxymethyl)methylamine 6.07g
Chlorid sodný 8.7g
Koncentrovaná kyselina chlorovodíková

Metoda

Rozpus?te soli v 900 ml destilované nebo deionizované vody. P?idejte koncentrovanou HCl k dosažení pH 7.6. Dopl?te na 1 L vodou.

3) Roztok k ?ed?ní protilátek

PBS (viz výše) s obsahem 0.1% bovinního sérumalbuminu a 0.1% azidu sodného.

4) Skladování protilátek

Mnohé protilátky mohou být skladovány ?ed?né p?i 4°C po dlouhou dobu, avšak imunoreaktivita by m?la být periodicky testována. Normální sérum pro blokování lze obdobn? skladovat.

Nepoužívejte roztok pro peroxidázou zna?ené protilátky, protože azid sodný enzym inhibuje. K ?ed?ní použijte pouze PBS a z?ed?nou protilátku neskladujte.

V?tšina nezna?ených protilátek m?že být skladována zmrazená na -20°C, rozd?lte však zásobu na vhodné alikvoty, aby se zamezilo opakovanému rozmrazení a zamrazení. Preferováno je jediné rychlé zmrazení a rozmrazení. Pokud je to možné, zmrazte alikvoty p?ed vložením do mrazáku v tekutém dusíku. Nezamrazujte protilátky ?ed?né více než 1/100.

N?které protilátky jsou dodávány ?ed?né 1:1 v glycerolu. To zabra?uje solidifikaci protilátky v mrazáku a zásobu lze bez škody vyjímat a znovu ukládat. Výchozí ?ed?ní je nutno vzít v úvahu p?i p?íprav? pracovního roztoku. 

5) Blokáda endogenní peroxidázové aktivity

Doporu?uje se peroxid vodíku v metanolu/PBS

Reagencie

30% peroxid vodíku 1 ml
70% metanol v PBS 100 ml
(0.3% peroxid vodíku)

Metoda

P?ipravte roztok H2O2 bezprost?edn? p?ed použitím. Pono?te preparáty na 30 minut, pak opláchn?te v PBS. 

6) Tepeln? zprost?edkované odhalení antigenu

0.01M Citrátový pufr, pH 6.0

Pro 2 L:

Reagencie

Kyselina citrónová 3.8g
2 M hydroxid sodný (8% aq)

Metoda

Rozpus?te kyselinu citrónovou v 1.9 l vody
P?imíchejte roztok hydroxidu sodného (za míchání) až pH dosáhne 6.0.(Je t?eba 20-30 ml). Dopl?te na 2 l vodou.
Pufr lze uchovávat p?i pokojové teplot? n?kolik dní nebo v lednici p?i 4°C.

Tris/EDTA pufr, pH9.0

Reagencie

Pro 1 L (10x koncentrovaný)
Tris(hydroxymethyl)methylamin 12 g
Ethylen-diamin tetra-octová kyselina, dehydrovaná sodná s?l 1 g
1 M kyselina chlorovodíková, p?ibližn? 500 ml
Voda 500 ml

Metoda

Rozpus?te soli ve vod?.
P?imíchejte kyselinu chlorovodíkovou, míchejte a kontrolujte pH na pH 9.0
Tento roztok pufru je 10krát koncentrovaný. Skladujte p?i 4°C a ?e?te pro použití.

Metoda mikrovlnné trouby*

Použitím mikrovlnné trouby pro domácnost s oto?nou plochou

1. Vložte do trouby 400 ml pufru v krytém plastovém kontejneru spolu s 200 ml destilované vody v plastové kádince. Zah?ívejte 2 min. p?i 750 W. Roztoky by se m?ly oh?át na 40 – 60°C. Vyjm?te vodu a postavte vedle pro dopl?ování.
2. Nalejte pufr do plastového nosi?e s preparáty, dbejte , aby skla byla pokryta. P?iklopte kontejner víkem nebo p?ikryjte voln? potravinovou fólií. Vyzna?te úrove? tekutiny v kontejneru.
3. Zapn?te troubu p?i 750 W na 5 minut. Roztok by se m?l va?it.
4. Kontrolujte hladinu a dopl?ujte teplou destilovanou vodou, je –li t?eba (pozor na páru p?i odkláp?ní víka kontejneru).
5. Opakujte kroky 3 a 4 požadovanou dobu - zpravidla 10 až 30 minut, to je však t?eba stanovit pro každý antigen.**
6. Vyjm?te kontejner v ochranných rukavicích a p?eneste do výlevky. Opatrn? odstra?te víko a oplachujte studenou vodou až pomine riziko, že by po vyjmutí stojánku s preparáty na nich mohl pufr krystalizovat. Opláchn?te v kohoutkové vod? a vložte do PBS.
7. Opláchn?te ve vod?, p?eneste do PBS a pokra?ujte imunocytochemickou metodou.
   1. jsou r?zné postupy, jak organizovat tepelné odhalení antigenu. Následující je používán v laborato?i autorky.
   2. **Pokud jsou odhalovány epitopy vyžadující r?zné ?asy, za?íná se t?mi, které vyžadují nejdelší zah?ívání a další jsou následn? p?idávány podle odpovídajících ?as?. To zamezí nutnosti vyjímat preparáty z horkého roztoku, což by mohlo vést k precipitaci solí pufru na preparátech.

7) Diaminobenzidinový roztok pro vyvolání peroxidázy (Pelliniemi et al, 1965)

Inkuba?ní roztok:

Reagencie

3,3’-Diaminobenzidin tetrahydrochlorid – DAB- (nap?. Sigma-Aldrich D5637) 50 mg
PBS 100 ml
Peroxid vodíku (30%), 30 µl (finální koncentrace 0.03%)

DAB lze koupit jako tablety nebo roztok, které se p?idávají do pufru. Pokud si chcete p?ipravit vlastní, kupte balení 5g nebo 25 g; abyste nemuseli odvažovat prášek, rozpus?te celé množství v destilované vod? na roztok o obsahu 50 mg DAB/ml. Promíchejte (zakryté) po dobu 15 minut v digesto?i, poté rozd?lte na alikvoty pro použití. Nap?íklad 5 ml alikvoty na 500 ml nebo 1 ml alikvoty na 100 ml výsledného 0.05% inkuba?ního roztoku. Zaví?kujte nádobky a umíst?te do mrazáku -20°C. P?ed použitím rozmrazte a p?idejte do odpovídajícího množství PBS. P?idejte peroxid vodíku na výslednou 0.03% koncentraci, dob?e zamíchejte a inkubujte preparáty po 10 minut.

Opláchn?te v PBS, pak ve vod? a pokra?ujte jaderným barvením.

Bezpe?ná likvidace DAB

DAB je t?eba likvidovat podle lokálních bezpe?nostních pravidel. Jde o potenciální kancerogen a nesmí být vylit do odpadu.

8) Imunocytochemický pr?kaz – manuální metoda

Fixovaný cytologický preparát: pokud byl použit PEG, odstraníme ve dvou lázních 95% metanolu). Zahr?te pozitivní a negativní kontrolní preparáty.

N.B. Po?adí krok? 1 a 2 m?že být zm?n?no, pokud to skýtá výhodu.

TBS m?že být nahrazen PBS, je-li preferován.

1. Blokáda enzym? typu endogenní peroxidázy
   pono?te skla do 0.3% peroxidu vodíku v 70% metanolu v PBS (1 ml 30% H₂O₂ ve 100 ml 70 % metanolu v PBS) po 30 minut. Opláchn?te krátce v PBS.
2. Odhalení antigenu viz výše
3. Dbejte, aby preparát neoschl a osušte okolí vzorku, obkreslete kroužkem izola?ním perem, vložte na stojánky do vlhké kom?rky a aplikujte tekutinu k blokád? pozadí – bloka?ní sérum (normální sérum od druhu, na n?mž je vytvo?ena sekundární protilátka ?ed?né 1/10 v protilátkovém ?edícím roztoku). Zakryjte inkuba?ní kom?rku a ponechte 10 minut. Odlijte sérum a opláchn?te krátce v PBS.
4. Osušte sklo mimo oblast preparátu. Odlijte co nejvíce pufru z preparátu (aby nedošlo k z?ed?ní následn? aplikované protilátky) a zajist?te, že izola?ní kroužek je suchý. Vra?te do vlhké kom?rky a aplikujte optimáln? ?ed?nou primární protilátku. P?esné množství není d?ležité, ale protilátka musí pokrýt plochu preparátu. Opakujte s pozitivním kontrolním preparátem (jeden pro každou použitou protilátku) a s negativním kontrolním preparátem (jedním pro každý testovaný p?ípad) s použitím PBS místo primární protilátky. Vra?te víko a nechte inkubovat jednu hodinu p?i lokální teplot? , nebo p?es noc p?i 4°C podle místní optimalizace.
5. Odlijte primární protilátku a umíst?te skla do stojánku s PBS. Vyperte t?ikrát v PBS po p?ti minutách.
6. Osušte sklo jako p?edtím a umíst?te do vlhké kom?rky (p?i teplot? místnosti). Aplikujte zna?enou sekundární protilátku (proti myší Ig nebo proti králi?í Ig, nebo jiných druh? Ig) v optimálním ?ed?ní na 30 minut nebo podle instrukcí výrobce. N?které kity poskytují “univerzální” sekundární protilátku, která bude reagovat jak s myšími, tak s králi?ími imunoglobuliny.
7. Vyperte ve t?ech lázních PBS, pak osušte skla a vra?te do kom?rky. Vyvolejte peroxidázu podle instrukcí na kitu (obvykle 5 až 10 minut). Je d?ležité používat stejný vyvolávací ?as, aby bylo možno porovnat výsledek reakce mezi vzorky a antigeny. N.B. p?i práci s DAB noste rukavice– je to potentiální kancerogen.
   Pro vlastní p?ípravu vyvolávacího roztoku viz p?íloha)
8. Odlijte DAB (ohledn? bezpe?né likvidace roztoku DAB viz dodatek)
   Opláchn?te skla v PBS, pak v tekoucí vod?.
9. Dobarv?te jádra lehce hematoxylinem obvyklým zp?sobem, diferencujte v kyselém alkoholu a “mod?idle”, pokud t?eba. Odvodn?te vzestupnou ?adou alkohol?, projasn?te v xylénu a montujte do syntetické prysky?ice.

9) Poloautomatická metoda s použitím nosi?? Sequenza™

Kroky metody jsou stejné jako p?i manuálním postupu, pouze kroky 1) a 2) je lepší obrátit. Preparáty jsou umíst?ny do nosi?? Sequenza po demaskaci antigenu a blokáda endogenní peroxidázy se provádí v nosi?i. Oplachovací kroky trvají 5 minut každý a provád?jí se s PBS obsahujícím 0.05% Tween 20. To je detergent, který pomáhá pufru hladce stékat po skle. Prostor mezi sklem a víkem je napln?n pufrem (z omývací láhve) a protéká 3 až 5 minut. Ov??te vizuáln?, že veškerý pufr odtekl p?ed aplikací protilátky, aby nedošlo k jejímu z?ed?ní.

Každý protilátkový krok vyžaduje 100 µl ?ed?né protilátky na preparát.

Vyvolání peroxidázy a jaderné barvení (s použitím Mayerova Haemalaunu, který nevyžaduje diferenciaci) m?že být provedeno v nosi?ích Sequenza, pokud byly standardizovány ?asy. Likvidace roztok? z nosi?? probíhá u použitého roztoku DAB stejn? jako u manuální metody.

Po tomto kroku odkryjte víko /krycí desku nosi?e, odd?lte je od sebe pod vodou v d?ezu, p?eneste skla do stojánk? pro odvodn?ní, projasn?ní a montování jako obvykle.

Pokud se víko obarví DABem, umíst?te ho p?es noc do vody s b?lícím ?inidlem (chlornan sodný). Dbejte, aby se hladká ví?ka nepoškrábala. Opláchn?te je v destilované nebo deionizované vody a nechte jednotliv? oschnout p?ed uložením.