?edící roztok

Standardním ?edícím roztokem pro primární protilátky je fyziologický roztok (0.87% NaCl) pufrovaný 0.01M fosfátovým pufrem pH 7.2 až 7.4 (PBS) s obsahem 0.1% bovinního sérum albuminu (BSA) a 0.1% azidu sodného jako konzerva?ního ?inidla. Lze užít i fyziologický roztok pufrovaný Tris/HCl-pufrem pH 7.6 (TBS). BSA p?sobí jako inertní protein, který se dokáže vázat na kterékoli “lepkavé” místo na st?n? zkumavky a tak udržovat molekuly drahocenné protilátky volné v roztoku. Mnohé protilátky mohou být v tomto ?ed?ní skladovány p?i 4°C, což zajiš?uje uniformitu test?, p?i dlouhodobém skladování je však záhodno testovat jejich reaktivitu. 

Optimalizace ?ed?ní

Primární protilátky mohou být dodány “p?ipravené k použití” nebo jako koncentráty. Doporu?uje se vždy vyzkoušet sérii ?ed?ní, aby bylo nalezeno optimální ?ed?ní ve vztahu k používanému detek?nímu systému, který m?že být více nebo mén? citlivý než ten, který testoval dodavatel. Monoklonální protilátky obvykle reagují dob?e v rozmezí 1 až 20 µg/ml. Polyklonální protilátky jsou variabiln?jší od ?ed?ní 1/100 do 1/10,000 i více.

Testování se provádí na preparátech tkán? se známou p?ítomností antigenu metodou, která bude užívána pro diagnostické postupy. Z ekonomických d?vod? se používá nejvyšší ?ed?ní poskytující silnou imunoreaktivitu antigenu spolu s co možná nejslabším nespecifickým p?ibarvením “pozadí”. To by m?lo zajistit nadbytek protilátky oproti antigenu a stát se standardem pro všechny p?íslušn? vyšet?ované preparáty. Pokud nejsou dostupné pozitivní cytologické kontrolní preparáty, lze testovat na parafinových ?ezech vhodné tkán? a nalezené optimální ?ed?ní bude vhodné pro cytologické preparáty.

Sekundární protilátky (pokud nejsou dodány p?ed?ed?né) , by m?ly být rovn?ž testovány a zpravidla dob?e reagují v rozsahu od 1/100 do 1/500. Sekundární zna?ené protilátky by nem?ly být skladovány p?ed?ed?né, nebo? existuje ur?ité riziko odlou?ení zna?ek. Peroxidázou zna?ené protilátky nesmí být ?ed?ny nebo skladovány v roztocích s obsahem azidu sodného, protože tento inhibuje enzymatickou reakci. Pro ?ed?ní protilátky použijte pouze PBS.

?as reakce

Primární protilátka se zpravidla nechává reagovat na preparátech po dobu jedné hodiny p?i pokojové teplot? a sekundární protilátka po dobu 30 minut. Nicmén? se všemi bloka?ními kroky a odmývacími postupy m?že procedura od po?átku do konce trvat n?kolik hodin. Pokud procedura je provád?na “ru?n?”, m?že být výhodné nechat primární protilátku reagovat p?es noc (p?i 4°C ve vlhké kom?rce) a dokon?it proces následující den. ?ed?ní monoklonální protilátky zpravidla nevyžaduje v tomto uspo?ádání adjustaci, jelikož je v roztoku pouze jeden typ protilátky. Polyklonální protilátka m?že vyžadovat p?i delší inkubaci vyšší ?ed?ní, protože roztok obsahuje sm?s protilátek k r?zným epitop?m téhož antigenu, p?i?emž n?které mohou být “pomalejší” a nereagovat p?i kratší inkuba?ní dob?. Navíc v polyklonálním antiséru budou na?ed?ny i nežádoucí imunoglobuliny, které by vyvolaly nespecifickou vazbu. P?i zm?n? inkuba?ní doby je tedy nutno vyzkoušet sérii ?ed?ní. Po aplikaci primární protilátky by preparáty m?ly být ponechány spíše v ní než v pufru, v n?mž by se slab? navázané protilátky mohly uvolnit.