Standardním ?edícím roztokem pro primární protilátky je fyziologický roztok (0.87% NaCl) pufrovaný 0.01M fosfátovým pufrem pH 7.2 až 7.4 (PBS) s obsahem 0.1% bovinního sérum albuminu (BSA) a 0.1% azidu sodného jako konzerva?ního ?inidla. Lze užít i fyziologický roztok pufrovaný Tris/HCl-pufrem pH 7.6 (TBS). BSA p?sobí jako inertní protein, který se dokáže vázat na kterékoli “lepkavé” místo na st?n? zkumavky a tak udržovat molekuly drahocenné protilátky volné v roztoku. Mnohé protilátky mohou být v tomto ?ed?ní skladovány p?i 4°C, což zajiš?uje uniformitu test?, p?i dlouhodobém skladování je však záhodno testovat jejich reaktivitu.
Primární protilátky mohou být dodány “p?ipravené k použití” nebo jako koncentráty. Doporu?uje se vždy vyzkoušet sérii ?ed?ní, aby bylo nalezeno optimální ?ed?ní ve vztahu k používanému detek?nímu systému, který m?že být více nebo mén? citlivý než ten, který testoval dodavatel. Monoklonální protilátky obvykle reagují dob?e v rozmezí 1 až 20 µg/ml. Polyklonální protilátky jsou variabiln?jší od ?ed?ní 1/100 do 1/10,000 i více.
Testování se provádí na preparátech tkán? se známou p?ítomností antigenu metodou, která bude užívána pro diagnostické postupy. Z ekonomických d?vod? se používá nejvyšší ?ed?ní poskytující silnou imunoreaktivitu antigenu spolu s co možná nejslabším nespecifickým p?ibarvením “pozadí”. To by m?lo zajistit nadbytek protilátky oproti antigenu a stát se standardem pro všechny p?íslušn? vyšet?ované preparáty. Pokud nejsou dostupné pozitivní cytologické kontrolní preparáty, lze testovat na parafinových ?ezech vhodné tkán? a nalezené optimální ?ed?ní bude vhodné pro cytologické preparáty.
Sekundární protilátky (pokud nejsou dodány p?ed?ed?né) , by m?ly být rovn?ž testovány a zpravidla dob?e reagují v rozsahu od 1/100 do 1/500. Sekundární zna?ené protilátky by nem?ly být skladovány p?ed?ed?né, nebo? existuje ur?ité riziko odlou?ení zna?ek. Peroxidázou zna?ené protilátky nesmí být ?ed?ny nebo skladovány v roztocích s obsahem azidu sodného, protože tento inhibuje enzymatickou reakci. Pro ?ed?ní protilátky použijte pouze PBS.
Primární protilátka se zpravidla nechává reagovat na preparátech po dobu jedné hodiny p?i pokojové teplot? a sekundární protilátka po dobu 30 minut. Nicmén? se všemi bloka?ními kroky a odmývacími postupy m?že procedura od po?átku do konce trvat n?kolik hodin. Pokud procedura je provád?na “ru?n?”, m?že být výhodné nechat primární protilátku reagovat p?es noc (p?i 4°C ve vlhké kom?rce) a dokon?it proces následující den. ?ed?ní monoklonální protilátky zpravidla nevyžaduje v tomto uspo?ádání adjustaci, jelikož je v roztoku pouze jeden typ protilátky. Polyklonální protilátka m?že vyžadovat p?i delší inkubaci vyšší ?ed?ní, protože roztok obsahuje sm?s protilátek k r?zným epitop?m téhož antigenu, p?i?emž n?které mohou být “pomalejší” a nereagovat p?i kratší inkuba?ní dob?. Navíc v polyklonálním antiséru budou na?ed?ny i nežádoucí imunoglobuliny, které by vyvolaly nespecifickou vazbu. P?i zm?n? inkuba?ní doby je tedy nutno vyzkoušet sérii ?ed?ní. Po aplikaci primární protilátky by preparáty m?ly být ponechány spíše v ní než v pufru, v n?mž by se slab? navázané protilátky mohly uvolnit.