Příprava a fixace vzorků

Pokud vzorek obsahuje dostatek materiálu poté, kdy byly p?ipraveny nát?ry a cytospiny pro okamžité hodnocení, metodou volby je sto?it zbytek materiálu do bun??né pelety, která se fixuje 10% formalinem (pufrovaném fosfátovým pufrem). Následuje odvodn?ní vzestupnou ?adou alkohol? a zalití do parafinu pro krájení. To umož?uje po?ízení mnoha ?ez? pro pro imunocytochemické testy. ?ezy z t?chto blok? musí být podrobeny odhalení antigen? zah?íváním v pufru a napnuty na vysoce adhezivní pozitivn? nabitá podložní skla, aby se zabránilo odlou?ení v pr?b?hu zah?ívání. 

V?tšina vzork? doru?ených do cytologické laborato?e není dost objemných pro výše uvedené postupy a jsou zpracovávány zhotovením cytospin? nebo cytologií z tekutého média (liquid-based cytology-LBC). Cytospinové preparáty vytvo?ené ze suspenze bun?k v p?vodní tekutin? vytvo?í stejnom?rn? rozprost?enou vrtsvu bun?k v malé ploše podložního skla; preparáty mohou být fixovány zaschnutím pro následnou postfixaci, pop?. za vlhka v alkoholu. Týž postup lze použít u nát?r?. LBC zahrnuje prefixaci vzorku ve fixativu na bázi alkoholu. Preparát se vytvá?í v p?ístroji, který filtruje tekutinu z bun??ného vzorku a vytvá?í tenkou vrstvu bun?k na p?eddefinovanou plochu podložního skla. Preparáty jsou excelentní kvality , ale objem vyžadovaný na vytvo?ení jednoho preparátu je pom?rn? velký, což omezuje jejich po?et a p?ístroje i skla jsou drahá, i když samotné fixativum drahé není. 

Dlouhodobé uchování vzork?

Vzhledem k ekonomickým faktor?m mohou být cytospiny a “Thinprep™” LBC metoda popsané výše za hranicemi dostupnosti pro laborato?e v rozvojových zemích. Stejn? tak imunocytochemické testy, které potvrzují diagnózu stanovenou primárn? klinicky a pomocí základních barvení dle Giemsy nebo Papanicolaoua. Mnohá odd?lení proto posílají vzorky do zahrani?í k up?esn?ní diagnózy; je smutné, že omezený vzorek nez?ídka dorazí nedostate?n? zachovaný pro další vyšet?ování. Nap?. nát?ry fixované zaschnutím, i když byly p?edtím ofixovány alkoholem, budou z?ejm? trp?t narušením antigen?, pokud nebyly udržovány zmrazené a transportovány na suchém ledu. Za vlhka fixované , nebo zaschlé nát?ry fixované ve formolu mohou být rehydrovány pono?ením na 5 minut do fyziologického roztoku p?ed další fixací nebo imunoprocedurami (Leong et al, 1999), avšak ve všech t?chto postupech m?že být výsledek nespolehlivý. 

Existují však dv? jednoduché metody pro uchování morfologie a antigenicity cytologických vzork? pro zasílání do jiné laborato?e. První je doporu?ením UKNEQAS pro imunocytochemie a vztahuje se k nát?r?m, otisk?m, nebo cytospinovým preparát?m. P?ed nebo po fixaci v alkoholu, aniž by skla sm?la zaschnout, jsou pokryta roztokem 10% polyetylénglykolu 1450 (PEG) v 50% metanolu, pak se nechají zaschnout (p?i pokojové teplot?) p?ed uložením, nebo odesláním. PEG vytvo?í tenký film chránící antigeny a neovlivní morfologii bun?k (Maxwell et al, 1999; Kirbis et al, 2011). Odstraní se p?ed imunocytochemickou procedurou ve dvou lázních 95% metanolu a pokra?uje se požadovanou fixací. Komer?ní verze roztoku PEG - Cytofixx již se nevyrábí. 

Druhá metoda má výhodu v poskytnutí více materiálu a nevýhodu v nutnosti transportu v alkoholickém roztoku, což m?že vyvolat problémy u p?epravc? (nicmén? si níže povšimn?te podmínek uchování a transportu s užitím roztoku PEG). Tenkojehlové aspiráty nebo jiné typy bun??ných vzork? jsou umíst?ny p?ímo do alkoholického fixativa užívaného pro LBC jako nap?. PreservCyt™ (70% metanol ve zna?kovém pufru) a mohou být transportovány v tomto roztoku nebo skladovány p?i b?žné teplot? bez omezení. Máme imunocytochemické preparáty vytvo?ené tímto postupem z jedné africké zem? po 6 letech skladování v roztoku PreservCyt p?i pokojové teplot? a výsledky jsou stejné, jako p?i bezprost?edním zpracování. Pokud je vzorek krevnatý nebo hlenovitý, m?že být nejprve proprán v 50% pufrovaném alkoholu – (nap?. Cytolyt ™) nebo Espostiho tekutin? (viz dodatek) po krátkou dobu k odstran?ní protein? a lýze erytrocyt?. Po centrifugaci je supernatant odlit a nahrazen fixativem. I bez proprání, které m?že být obtížné bez dostupnosti personálu a centrifugy, lymfomy a jiné FNA vzorky umíst?né do 2 ml roztoku PreservCyt si udržují excelentní morfologii a imunocytochemickou reaktivitu. P?i delším skladování je t?eba kontrolovat hladinu fixativa, aby nedošlo odpa?ení a p?ípadn? roztok doplnit. Vedle imunocytochemie jsou vzorky vhodné i pro extrakci DNA pro genetické studie a in situ hybridizaci, (nap?. EBER pro EBV a c-myc translokaci) (Van Noorden et al 2011).

Za ú?elem uchování materiálu pro budoucí vyšet?ování používáme naprosté minimum vzorku z fixativa PreservCyt. A?koli cytospiny by poskytly p?kný výsledek, bylo by na n? t?eba více materiálu; my vysta?íme s pouhými 1.5 µl bun??né suspenze kápnuté na pozitivn? nabité sklo. ponecháme 1 hodinu zaschnout. Poté je plocha vzorku obkroužena diamantem na spodní stran? skla, jinak je ji t?žké na mokrém preparátu identifikovat. Preparáty jsou postfixovány v 10% formalinu po dobu 10 minut, opláchnuty ve fyziologickém roztoku a vyšet?ovány základním barvením a standardní imunocytochemií. Zahrnuje demaskaci antigenu zah?íváním v pufru po dobu 20 minut v mikrovlnné troub?. Až dosud jsme nezjistili antigen, který by nešlo detekovat tímto zp?sobem, a? se jednalo o lymfomy, neurogenní tumory, karcinomy atd. a zjistili jsme, že lze použít obvyklá ?ed?ní protilátek. Nevýhodou je, že se díváme v preparátu na celé bu?ky a n?kdy je obtížné rozlišit p?i p?ekryvu bun?k jadernou a cytoplazmatickou pozitivitu. Nicmén? hematoxylinem mod?e dobarvená jádra lze zpravidla dob?e odlišit od hn?dé (DAB) immunoperoxidázové reakce. Jiným problémem je matrix, která n?kdy obklopuje bu?ky a m?že reagovat s n?kterými protilátkami, z?ejm? proto, že obsahuje antigen, ale bu?ky lze v?tšinou od tohoto pozadí odlišit. Úsp?ch metody však z?stává závislý na kvalit? p?vodního vzorku. 

Preparáty si p?ipravujeme p?edem z materiálu fixovaného v PreservCyt a p?ed nebo po formalinovém fixa?ním kroku kryjeme filmem roztoku PEG, jak bylo výše popsáno. Oschlá skla mohou být takto skladována týdny až m?síce a poslána do jiného centra, pokud by transport v alkoholovém fixativu byl obtížný. Metoda je nenákladná, (fixativum a PEG jsou levné) a nevyžaduje p?ístrojové vybavení až na mikropipetu a špi?ky a m?že tak být využívána v rozvojových zemích. Doporu?uje se užití adhezivních pozitivn? nabitých skel. Fixativa na bázi alkoholu zvyšují permeabilitu bun??né membrány, takže roztoky protilátek lépe pronikají do bun?k. Pokud je materiál primárn? fixován ve formalinu, m?že být nutné za?adit permeabiliza?ní krok s detergentem (nap?. Triton X-100, 0.2% nebo Tween 20, 0.05-0.2%) p?ed vlastní imunocytochemickou procedurou. 

X