Cytologie z tekutého média

Principy p?ípravy preparát? v LBC

  1. Bun??ný vzorek je získán z hrdla obvyklým st?rem
  2. Vzorek je p?enesen do kontejneru s transportním/fixa?ním roztokem
  3. Bu?ky jsou dispergovány v roztoku
  4. ?ást vzorku je zpracována
  5. Bu?ky jsou odd?leny centrifugací nebo filtrací a umíst?ny v tenké vrstv? na podložním skle (monolayer) sedimentací nebo tlakem
  6. Preparáty jsou barveny a montovány pro mikroskopické vyšet?ení 

V sou?asné dob? je užíváno n?kolik systém?. Nej?ast?ji jsou to:

  • Sure Path (autocyte, TriPath Imaging)
  • Thin Prep (CYTYC)        
Surepath Processing system
Thinprep 2000 processor (CYTYC)

 

Hlavní znaky systém? Surepath a Thinprep

  •  K odb?ru vzork? pro LBC se doporu?uje kartá?ek nebo št?ti?ka. Nástroj je 5x oto?en kolem cervikálního ústí ve sm?ru hodinových ru?i?ek.
  • Hlava kartá?ku je odd?lena a vložena do roztoku s fixativem (SurePath) nebo ?ádn? vymáchána (Thin Prep)
  • Bu?ky jsou ze suspenze odd?leny centrifugací (Surepath) nebo filtrací (Thin Prep)
  • Bu?ky jsou umíst?ny na sklo v oválném nebo okrouhlém poli pomocí sedimentace (Surepath) nebo kontrolovaného tlaku (Thin Prep)
  • Pole pro mikroskopii má pr?m?r 13 mm (Surepath) nebo 20mm (ThinPrep)
  • Jak Surepath tak Thin Prep systémy jsou automatizované

Porovnání odb?ru a zpracování konven?ních nát?r? a LBC preparát?:

P?íprava konven?ního nát?ru
P?íprava konven?ního nát?ru
P?íprava konven?ního nát?ru
P?íprava preparátu z tekutého media
P?íprava preparátu z tekutého media
P?íprava preparátu z tekutého media

 

Výhody LBC

  • Okamžitá fixace se zlepšením jaderných a cytoplasmatických detail?
  • Všechen odebraný materiál je k dispozici pro zpracování
  • Zpracován je reprezentativní vzorek, lze však p?ipravit více preparát?
  • ?istší pozadí- lepší viditelnost epiteliálních bun?k
  • Tenká vrtsva a konstantní rozsah pozorovaného pole snižují ?as nutný pro screening oproti konven?ním nát?r?m
  • Podíl nereprezentativních preparát? klesá
  • LBC vzorky jsou vhodné pro dopl?kové testy, nap?. HPV testing
  • LBC vzorky jsou vhodné pro automatizovanou analýzu

Nevýhody LBC

  • Obrazce z nát?r? jsou rozrušeny randomizací bun?k
  • Abnormální bu?ky jsou roztroušeny
  • ?ídké LBC preparáty jsou obtížn? interpretovatelné
  • Krev, hlen, zán?t a znaky nádorové diatézy jsou do ur?ité míry stále p?ítomny, ale vypadají pon?kud jinak
  • Epitelie jsou p?evážn? jednotliv?, vypadají menší než v konven?ních nát?rech – zejm. endocervikální a nezralé metaplastické bu?ky
  • LBC je dražší než konven?ní test

Adekvátnost LBC vzork?

Ve všech studiích publikovaných ve Velké Británii poklesl se zavedením LBC podíl neadekvátních vzork?, i když výsledky mezinárodních studií byly variabilní. To bylo rozhodujícím faktorem, zda p?ejít ve Velké Británii na LBC. Podstatnou otázkou je, zda redukce podílu neadekvátních vzork? je bezpe?ná. Nem?níme neadekvátní vzorky na adekvátní negativní a neztrácíme p?itom abnormální nálezy? Je z?ejmé že na kriteriích adekvátnosti LBC je t?eba ješt? pracovat. Je známo, že u konven?ních nát?r? se kriteria adekvátnosti mezilaboratorn? liší a tato diagnostická kategorie je obtížn? standardizovatelná.

Bethesda kritéria pro ur?ení adekvátnosti LBC vzork?

  • Každý vzorek s obsahem abnormálních bun?k je adekvátní
  • Nejmén? 5,000 dob?e viditelných/zachovalých dlaždicových bun?k na skle
  • Nejmén? 10 polí by m?lo být spo?ítáno objektivem 40x podél pr?m?ru procházejícího centrem preparátu
  • Preparáty s mén? než 5000 bun?k by m?ly být podrobeny kontrole k ur?ení p?í?iny

Pr?m?rný po?et bun?k v zorném poli k dosažení 5000 bun?k je ukázán v následující tabulce. Pokud preparát obsahuje hypocelulární nebo prázdná pole, je t?eba ur?it jejich podíl. 

Guidelines for estimating the cellularity for Liquid Based Cytology slides (Ref. The Bethesda System 2001)
View rapid method of evaluating cellularity 1
View rapid method of evaluating cellularity 2

LBC zm?ny bun??né morfologie

Hlavní vliv LBC na bun??nou morfologii spo?ívá v :

  • Ztrát? vztah? mezi bu?kami a jejich náhodným rozhozením
  • Roztroušením abnormálních bun?k
  • ?ídké monolayery mohou být obtížné pro screening a interpretaci

To je ilustrováno v následujících preparátech

Celkový vzhled nát?ru

Celkový vzhled nát?ru je zrušen – nikoli však bun??ná architektura a pozadí podobné tomu, které se nachází v konven?ních nát?rech. Pozadí je ?istší než v konven?ních nát?rech, což usnad?uje identifikaci normálních I abnormálních bun?k. Krev, hlen, zán?tlivý exudát a nekrotický detritus jsou rozpoznatelné, I když vypadají pon?kud jinak, než v konven?ních nát?rech; tzv. “nádorová diatéza” je v LBC nát?rech rozpoznatelná.
Nedostate?ná LBC
Dostate?ná LBC

 

Dlaždicové epitelie

Obecná morfologie epitelových bun?k je zachována, a?koli se v?tšinou vyskytují izolovan?. Trsy a plachty epitelových bun?k jsou zpravidla menší než v konven?ních nát?rech. Endocervikální a nezralé metaplastické  bu?ky se jeví menší. Chromatin je výrazn?ji granulovaný, z?stává však jemný, stejnom?rný. Jaderná membrána je hladká, m?že být zp?ehýbaná.

 

Endocervikální bu?ky

Typický je voštinovitý vzhled, ale vyskytují se i izolované bu?ky a proužky. Nahá jádra jsou v LBC z?ídkav?jší. Jádra jsou výrazn?jší, chromatin z?eteln?ji granulární. V cytoplazm? mohou být vakuoly hlenu a na povrchu cilie. Bu?ky mohou být n?kdy zakulacené nebo zkroucené – artefakty v d?sledku zpracování             

 

Nezralé metaplastické bu?ky

Nezralé metaplastické bu?ky  se v LBC preparátech zdají menší a vzbuzují tak dojem zvýšeného nukleoplasmatického pom?ru.  Hladká jaderná konture a jemn? granulární chromatin, n?kdy malé okrouhlé jadérko a denzní cytoplasma potvrzují  benigní povahu t?chto bun?k.  

 

Endometriální bu?ky jsou ?asto dob?e zachovalé v LBC preparátech na rozdíl od konven?ních, kde jsou zpravidla degenerované. Vyskytují se v trojrozm?rných trsech nebo koulích, ale mohou být i jednotliv?. Jádra mají kulatá nebo oválná, malá, pravidelná hyperchromní. Protože je krev v LBC lyzována, jsou v mentrua?ních vzorcích pouze stíny erytrocyt?. Mohou být p?ítomny histiocyty a detritus.

  • Krev je v LBC lyzována, proto jsou v mentrua?ních vzorcích pouze stíny erytrocyt?
  • Bu?ky jsou v transparentních trojrozm?rných trsech
  • Granulární chromatin a membránové záhyby jsou lépe viditelné

T?hotenství

Nezralé metaplastické bu?ky  se v LBC preparátech zdají menší a vzbuzují tak dojem zvýšeného nukleoplasmatického pom?ru.  Hladká jaderná konture a jemn? granulární chromatin, n?kdy malé okrouhlé jadérko a denzní cytoplasma potvrzují  benigní povahu t?chto bun?k.  

 

Prohlídka knihovny LBC ilustrací:

Candida
Candida
Clue cell
Endometrial cells
HSIL
HSIL
HSIL
HSIL
HSIL
HSIL
HSIL
Hyperkeratosis
Hyperkeratosis
Hyperkeratosis
Borderline ASCUS
Borderline ASCUS
Borderline ASCUS
Normal squamous epithelium
Degenerative effect of inflammation
Degenerative effect of inflammation
Degenerative effect of inflammation

 

Hodnocení LBC v anglických pilotních studiích

  • V ?ervnu 2000 vydal National Institute for Clinical Excellence(NICE) sm?rnice pro použití LBC v cervikálním screeningu.
  • Konstatoval, že LBC má významné výhody, ale d?kazy jsou kolísavé a z?stávají ur?ité nejistoty
  • Byl navržen program pilotní implementace LBC s plnou kontrolou v každém kroku
  • Tyto projekty m?ly vyhodnotit veškeré ú?inky, náklady, a praktické d?sledky zavedení LBC do cervikálního screeningového programu.
  • Výrobci dvou systém? - ThinPrep® (Cytyc® Corporation, Marlborough, MA, USA) a SurePath ™ (Tripath Imaging® Inc., Burlington, NC, USA) požádaly o zapojení jejich systém?; na dvou místech byl použit ThinPrep®, na jednom SurePath™.
  • Pilotní studie probíhaly v letech 2001-2 a bylo zpracováno 250,000 vzork? (a provedeno p?ibližn? 12500 HPV test?). Výsledky byly srovnány s obdobnými z p?edchozího období, kdy byly vyšet?ovány konven?ní nát?ry.
  • Vliv na laboratorní náklady zahrnující vybavení, spot?ební materiál a produktivitu zam?stnanc? byly kalkulovány v?etn? efektivity HPV t?íd?ní a psychologického efektu u žen s neodpovídajícím výsledkem nát?ru a pozitivním testem HPV .

Výsledky pilotní studie LBC v Anglii pokr.

  • Zavedení LBC snížilo z?eteln? podíl neadekvátních vzork? (z 9% na 1 – 2%). Podíl neadekvátních byl nižší v laborato?ích užívajících SurePath™ než t?ch , které užívaly ThinPrep™.
  • Nebyl doložen žádný vliv LBC na záchyt hrani?ních nález? nebo mírné dyskaryózy, ani vliv na záchyt st?ední a t?žké dysplazie.
  • Byl prokázán ur?itý efekt “nácvi?né k?ivky” s vyšším podílem hrani?ních a low grade nález? v pr?b?hu prvních dvou m?síc?.
  • Došlo k poklesu hlášených glandulárních neoplazií.
  • Senzitivitu nelze posoudit z pilotních studií, protože chybí údaje o falešn? negativních nálezech. Nicmén? podíl hlášených st?edních a t?žkých dysplazií a p?edb?žné výsledky pozitivní predik?ní hodnoty indikují shrnutím výsledk? ze všech míst citlivost srovnatelnou  s metodou konven?ní cytologie.
  • Produktivita laborato?í zavedením LBC stoupla screenováním v?tšího po?tu preparát? za hodinu; rozsah pracovních p?estávek z?stal zachován.
  • Redukce neadekvátních vzork? v  LBC snižuje náklady screeningu zpracováním menšího po?tu preparát?. Nap?íklad redukce neadekvátních nát?r? z 9% na 1.6% znamená pro laborato?, která ro?n? zpracuje 30,000 nát?r? redukci pracovního výkonu o 2,220 skel ro?n?. V celonárodním m??ítku by to znamenalo pokles pracovní zát?že ze 4,2 milionu preparát? ro?n? na 3,9 milionu.

Hodnocení LBC z jiných zemí

  • Národní cervikální screeningové programy jsou komplexní a multidisciplinární. R?zné zem? mají r?zné screeningové intervaly a postupy. Vliv zavedení LBC bude proto v každé zemi jiný.  12 laborato?í v Austrálii, 3 na Novém Zélandu, 11 v N?mecku, 7 ve  Francii, 20 v Holandsku a 8 ve Skotsku vyhodnotilo LBC a dosp?lo k r?zným záv?r?m.
  • Skotsko zavádí LBC
  •  Austrálie a Nový Zéland se rozhodly nepodpo?it LBC z ve?ejných zdroj?
  • N?mecká Cytologická spole?nost doporu?ila další studie a francouzské výsledky nejsou dosud puiblikovány.
  • Protože obrazy v LBC jsou odlišné, p?ed zahájením provozu s LBC  se musí screene?i i patologové interpretaci u?it.  
  • Sou?asní výrobci nabízejí t?ídenní p?eškolení
  • Cílem je školit školitele
  •  Cytologové, kte?í absolvují t?ídenní kurs mají následn? vyškolit celou laborato?
  • Cílem je pro cytotechnology dosáhnout  95% citlivosti v záchytu HSIL p?ed zahájením rutinního provozu s LBC

Zm?ny v pracovním procesu (Vyhodnocení LBC v Anglii  pokr.)

  • P?íprava preparát? LBC probíhá v p?ístrojích, které zpracují ro?n? 25 000 až 80 000 vzork?. Navrhované modely modernizace patologie založené na ?ízených sítích budou dob?e kompatibilní s p?ístroji této velikosti umož?ujícími centralizované zpracování vzork?  jejichž hodnocení m?že i nadále probíhat  v nemocnicích , v nichž je sou?asn? screenerský personál zam?stnán.
  • FDA schválený automatizovaný screening je v sou?asné dob? dostupný pro konven?ní nát?ry a pokud bude zaveden do praxe ve Velké Británii, m?že významn? snížit laboratorní zát?ž a nedod?lky.

LBC a screening HPV

  • Zavedení t?íd?ní podle výsledku HPV vedlo k 72% redukci opakovaných vyšet?ení, ale více než zdvojnásobilo indikace ke kolposkopii oproti p?edchozímu postupu.
  • Vzledem k chyb?jícím údaj?m o citlivosti HPV DNA analýzy z Velké Británie a vlivu na nár?st kolposkopií, je t?eba zaujmout p?i zavád?ní testace HPV  jako t?ídícího postupu zdrženlivý postoj, i když výsledky jsou slibné.

Záv?ry

  • Sou?asné výsledky dokládají, že zavedení LBC je opodstatn?no hlavn? zlepšenou produktivitou ve screeningovém programu, jak redukcí neadekvátních vzork?, tak zvýšením produktivity práce v laborato?i a také následným potenciálem pro automatizaci a dodate?né testy.
  • Spole?nost patolog? podržuje rezervovaný vztah k dostupným d?kaz?m senzitivity a adekvátnosti (které ovliv?ují produktivitu).
  • Je t?eba podotknout, že LBC nebyla testována v žádné longitudinální studii v zemích s t?í až p?tiletým screeningovým programem.
  • Je zásadní, aby LBC nebyla p?ece?ována jako citliv?jší než sou?asný screening.
  • Náklady na výcvik musí být správn? rozloženy. I nadále bude vyžadována schopnost hodnocení konven?ních nát?r?.           
X